细胞冻存与复苏应用方向、发展历史和冷冻技术-2
常用的细胞冷冻贮存器为液氮贮存器，规格有35L3和50L3两种。
细胞冻存时常备的材料有：0.25%胰蛋白酶，含10%～20%的血清培养液，DMSO（分析纯）或无色新鲜甘油（121℃蒸气高压消毒），2ml 安瓿（或专用细胞冻存管）、吸管、离心管、喷灯、纱布袋（或冻存管架）等。
主要操作步骤为：
（1）选择处于对数生长期的细胞，在冻存前一天最好换液。将多个培养瓶中的细胞培养液去掉，用0.25%
胰蛋白酶消化。适时去掉胰蛋白酶，加入少量新培养液。用吸管吸取培养液反复吹打瓶壁上的细胞，使其成为均匀分散的细胞悬液。悬浮生产细胞则不要消化处理。然后将细胞收集于离心管中离心（1000r/min，10分钟）。
（2）去上清液，加入含20%小牛血清的完全培养基，于4℃预冷15分钟后，逐滴加入已无菌的DMSO或甘油，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，细胞浓度为3×106～1×107/ml之间。
（3）将上述细胞分装于安瓿或专用冷冻塑料管中，安瓿装1～1.5ml在火焰喷灯上封口，封口处要完全封闭，圆滑无勾。冷冻管要将盖子盖紧，并标记好细胞名称和冻存日期，同时作好登记（日期、细胞种类及代次、冻存支数）。
（4）将装好细胞的安瓿或冻存管装入沙布袋内；置于液氮容器颈口处存放过夜，次日转入液氮中。采用控制降温速度的方法也可采用下列步骤：先将安瓿置入4℃冰箱中2～3小时，再移至冰箱冷冻室内3～4小时（此步可省略），再吊入液氮容器颈气态部分存放2小时，最后沉入液氮中。
2. 分布降温法
细胞系冻存程序：
1) 单层细胞的消化。将经24～48小时培养已长成单层的传代细胞培养物弃去生长液，加适量ATV，1～2分钟后倒弃ATV，再加入少量ATV液，经
0.5～1分钟倒去ATV，室温或37oC温箱作用2～3分钟，视细胞解离情况，拍打细胞培养瓶。使单层细胞完全解离。SP2/0瘤细胞，待生长好后用吸管吹打，再经1000转/分离心l0分钟。
2) 离心洗涤：向培养瓶内加5～10m1预冷的MEM使细胞悬浮，再将其吸出置灭菌离心管中，以1000rpm 离心8～10分钟后弃去上清液。
3) 细胞悬液的制备：向离心管内逐滴缓慢加入预冷的冻存保护液，使细胞浓度为150~400万/ml，然后迅速分装于安瓿瓶中，每瓶加量为lml。
4) 致冷冻结：将安瓿瓶放入带有棉垫的纸盒或塑料盒内，直立置不同条件下致冷冻结果保存：
a. 4℃两小时后移至-20℃作用2小时，再移入-40℃4小时后在-70℃下24小时投入液氮。
b. -20℃4小时后移至-40℃，经4小时移人-70℃冰箱24小时，投入液氮。
c. -40℃4小时后移入-70℃24小时后投入液氮。
d. -20℃4小时后移入-70℃经24小时后投入液氮中。
e. -70℃24小时后投入液氮中。
5) 液氮中保存：将冻结后的安瓿装入预冷的小布袋中，投入液氮。为防止安瓿漂浮，可预先在小布袋中加入几块小卵石。
3. 玻璃化法
玻璃化保存（Vitrification）是一种超速冷冻方法。它是以极快的速度冷冻细胞，使细胞内外的游离水迅速形成玻璃样物质，而不形成冰晶。这种保存方法既避免了由于慢速降温时导致的盐浓度升高，又防止了由于冰晶形成造成的物理损伤，可获得较高存活率。
玻璃化首先由Luyet在1937年提出，他认为生命是生物活体系统的原子或其他结构元的一种特殊排列．并且轻微的排列位置扰动就会破坏平衡从而导致死亡，而结冰时的驱动力会破坏这种特殊的排列，这就是冰冻死亡的原因。玻璃化比冻结固化方法引起的结构变化要小，因而是一种较理想的低温保存途径。
1981年，Fahy首先明确提出，用高浓度的低温保护剂溶液，可在较慢地冷却速率以及高压条件下实现完全的玻璃化，以后又发展了一些所谓“玻璃化溶液”，使细胞、组织乃至器官等范围广泛的生物系统玻璃化低温保存成为可能。
1985年，Rail和Fahy用这种玻璃化溶液使鼠胚胎玻璃化保存获得成功，是这种技术走向实用化的首次突破。
