环状RNA结合功能蛋白！找对方向20分文章水到渠成
环状RNA作为研究持续火热的明星分子，不同于对其丰富的表达谱研究，环状RNA功能机制研究还仅仅处在起步阶段。环状RNA研究多为miRNA海绵机制，部分circRNA可竞争性结合miRNA，解除miRNA对靶基因的抑制作用，上调靶基因的表达。其实，环状RNA可以通过结合不同种类的功能蛋白，分别在转录前、后及翻译水平严格调控细胞生殖生长等过程。云序曾对环状RNA经典研究思路进行过详细解析（2018国自然研究热点—环状RNA研究深度剖析），感兴趣的老师可以查询浏览。4月3日，知名免疫学杂志Immunity（IF：22.845）在线发表了中科院生物物理所范祖森教授与王硕研究员为共同通讯作者的文章，介绍发现环状RNA Cia-cGAS定位于细胞核，可结合DNA敏感的cGAMP合酶cGAS并抑制其活性，调控长效造血干细胞（LT-HSC）静息状态。本文极大拓展了核内环状RNA通过结合激酶发挥重要生理功能的研究思路。
研究背景：
造血干细胞（HSC）自我更新和分化之间的平衡打破将导致骨髓衰竭及恶性血液肿瘤发生。然而，HSCs如何维持其静止状态并避免I型干扰素（IFN）介导能量耗竭、细胞凋亡仍未可知。本文一种名为cia-cGAS的环状RNA，它在长效（LT）-HSCs细胞核中高度表达。小鼠Cia-cGAS缺陷将导致I型IFN在骨髓中高表达并伴随静息LT-HSC数量显著减少。在稳态条件下，cia-cGAS在细胞核中通过结合DNA传感器cGAS以阻断其合酶活性，由此保护静息LT-HSC免于被cGAS介导耗尽凋亡。此外，cia-cGAS与线性cGAS相比，与cGAS结合亲和力更强，由此抑制cGAS介导LT-HSCs中I型IFN产生。本文揭示了一个新型环状RNA——cia-cGAS可结合DNA敏感的cGAMP合酶cGAS并抑制其活性，调控长效造血干细胞（LT-HSC）静息状态。
研究思路：
本文首先基于高通量手段比较了小鼠中LT-HSC，ST-HSC和MPPs中全转录组变化，共发现156种显著性差异表达的circRNAs。表达量验证证实9个circRNA在LT-HSC中显著性上调。在细胞表型层面，发现只有干扰D430042O09Rik转录的circRNA——Cia-cGAS后，可明显改变造血干细胞的亚群分布，作者因此锚定Cia-cGAS进行机制分析。作者通过Cas-9基因敲除策略成功构建了Cia-cGAS基因敲除小鼠，在Cia-cGAS基因敲除小鼠中LT-HSC显著性减少，I型IFN表达升高。通过RNA Pull-down实验，作者发现Cia-cGAS可以与cGAS结合，cGAS-RIP实验反向证实二者之间具有直接的相互作用。后续，作者通过生信预测结合EMSA实验分析了Cia-cGAS与cGAS相互作用的位点信息。酶学研究证明，Cia-cGAS可通过结合cGAS并抑制其活性。
研究一：环状RNA分子筛选及验证
为探索造血干细胞功能相关的circRNA分子，作者比较了小鼠不同造血干细胞（LT-HSC，ST-HSC和MPPs）中全转录组变化情况，找出了156种显著性差异表达的circRNA分子，其中49种在LT-HSC中高表达。RNase R及qPCR实验证实其中9种为真实LT-HSC中高表达环状RNA 分子。为有效筛选造血干细胞相关的circRNA分子，作者通过体内circRNA干扰实验，发现只有干扰Cia-cGAS后才能明显影响小鼠体内造血干细胞亚群分布，并表现为LSK祖细胞数量显著性增加，与此同时LT-HSC细胞数量显著减少。因此，作者结合转录组数据以及体内、体外验证实验，最终锚定Cia-cGAS分子进行后续分子机制研究。
研究二：环状RNA分子细胞表型
作者发现Cia-cGAS是由D430042O09Rik (chr7: 125776974–125784712)的4、5、6号外显子连接成环。且位于外显子上下游的内含子区域具有成环所需高度同源序列。作者通过Cas9技术手段，敲除一端同源序列后，成功获得Cia-cGAS 敲除小鼠模型。敲除小鼠中LSK祖细胞显著增多，LT-HSC显著减少，且基因敲除小鼠出生6个月后会死于贫血。对基因敲除小鼠中LT-HSC进行BrdU染色，结果说明敲除小鼠中LT-HSC细胞处于增殖分裂活跃期。同时脉冲标记H2B-GFP小鼠模型证实Cia-cGAS敲除后，静息状态的LT-HSC细胞比例显著性降低。
研究三：环状RNA分子功能机制
在确定Cia-cGAS具有明显细胞表型之后，作者围绕其分子机制展开了详细的探索。为了找到Cia-cGAS影响下游的靶基因，作者在敲除Cia-cGAS后进行转录组分析，发现差异表达的基因与IFN-α下游靶基因是一致的。且当Cia-cGAS敲除后I型IFN mRNAs 表达量也显著性增高。最终，作者证实cia-cGAS通过调控I型IFN通路影响LT-HSC静息状态。接下来，作者针对Cia-cGAS在该通路中的作用机理进行了详细解析。作者直接采用RNA Pull Down技术手段找到与Cia-cGAS相互作用的功能蛋白。基于这一技术手段，作者发现Cia-cGAS与cGAS蛋白具有明显相互作用。cGAS RIP实验反向证实二者之间具有真实的相互作用。免疫荧光及FISH实验证实Cia-cGAS及cGAS细胞内共定位表达。基于EMSA等技术手段，作者找到了二者相互作用位点。后续作者补充大量生理生化实验，最终揭示LT-HSC中Cia-cGAS结合并抑制cGAS的活性，最终通过拮抗cGAS催化产物I型IFN来维持HSCs静息状态。
总结：
本文从环状RNA结合功能蛋白角度，成功的向我们展示了核内circRNA具有重要生理功能，以及该类型circRNA的研究方法。首先通过高通量测序筛选与造血干细胞干性维持相关的circRNA分子，围绕该分子设计一系列体内、体外干扰实验，确定其可引起干细胞干性维持相关细胞表型改变。后续，与circRNA 海绵机制研究类似，RNA Pull Down实验及RIP实验成为机制研究成功与否的关键钥匙。作者基于RNA Pull-down技术筛选到可能与Cia-cGAS相互作用的蛋白质，并进一步通过RIP实验反向验证。在补充大量生理生化实验后，作者向我们完整的描绘了Cia-cGAS如何维持HSCs静息状态。本文给我们提供了很好的范本，当我们筛选到的环状RNA定位于核内，或者不能与AGO2蛋白结合，不适合进行海绵机制研究时，我们可采取的研究策略。
云序专注于环状RNA研究，前期环状RNA筛选，云序提供全转录组及环状RNA测序相关服务；环状RNA验证，云序提供qPCR，RNaseR及Sanger测序等服务；文中环状RNA机制研究金钥匙——环状RNA Pull Down及RIP 环状RNA测序，云序均可提供全套服务！新年伊始，云序客户更是在环状RNA领域接连发表高分文章，包括世界首篇小鼠大脑创伤外泌体环状RNA文章；世界首篇非洲爪蟾环状RNA研究以及世界首篇红斑狼疮性肾炎环状RNA文章等等。云序致力于帮助客户在环状RNA研究领域占得先机，拔得头筹！
作者简介：
范祖森，二级研究员，现任中科院感染与免疫重点实验室副主任，国科大微免教研室副主任，中国科学院特聘核心骨干研究员,国科大岗位教授（A类）。范祖森1998年获上海交通大学医学院免疫学博士学位，随后到哈佛大学医学院从事博士后研究，于2003年晋升为哈佛大学讲师。2004年作为中国科学院“百人计划”研究员回到生物物理所工作，2005年获“杰出青年”基金资助，2006年入选“新世纪百千万人才工程”国家级人才。2010年享受“国务院特殊津贴”专家。2014年获得谈家桢生命科学创新奖，2016年评为中科院优秀研究生导师。课题组长期从事天然免疫抗感染应答调控、肿瘤干细胞和肿瘤免疫治疗等研究，在天然免疫细胞新亚群发现、天然免疫抗感染识别机制、肿瘤干细胞自我更新机制等方面，取得了一系列有国际影响力的原创性成果。以第一及通讯作者在Cell（2篇）、Nat Immunol（5篇）、Immunity（2篇）、Cell Stem Cell（2篇）、JEM（3篇）、JCI、NSMB、Nat Commun（8篇）、 EMBO J（2篇）、Blood等国际权威学术期刊发表SCI高水平研究论文70余篇，研究处于国际前沿。课题组经过多年的研究积累业已形成优秀的免疫学研究平台和优良的科研文化氛围，在天然免疫抗感染应答与肿瘤免疫领域培养出一支优秀的科研团队。已培养了30余位博士毕业生和近10位博士后，10余人获得中科院院长特别奖、优秀奖及优秀博士论文，有近10人晋升为教授岗位（包括北大、清华教授），3人获得中组部“青年千人”计划，1人获得基金委“优青”等。
云序产品推荐：
全转录组测序
环状RNA测序
环状RNA pulldown
RIP-环状RNA测序
m6A 环状RNA甲基化测序
m5C 环状RNA甲基化测序
m1A 环状RNA甲基化测序
上海云序生物科技有限公司
Shanghai Cloud-seq Biotech Co.,Ltd
地址：上海漕河泾高新技术开发区钦州北路1066弄
电话：021-64878766
网站：www.cloud-seq.com.cn
邮箱：market@cloud-seq.com.cn<
RNA甲基化领域是当前最耀眼的国际科研明星，也是国自然申请的大热点；究其原因，是因为最近一两年，RNA甲基化的功能与分子机制方面取得了巨大的进展。RNA甲基化已被证实在癌症发生发展，病毒感染，神经发育，干细胞分化等过程中发挥着关键作用。今天，我们承接上一期的癌症篇，为您带来病毒领域的RNA甲基化研究进展。
1.Nature Immunology：DDX46影响抗病毒RNA的去m6A甲基化，抑制细胞的抗病毒免疫应答
影响因子：21.5，2017.8.28
中国医学科学院联合上海第二军医大学团队证实RNA解旋酶DDX46通过RNA去甲基化修饰，抑制水泡型口炎病毒（VSV）的天然免疫应答。那为什么作者会锁定DDX46来做研究呢？因为大多数DDX家族成员参与mRNA剪接，其中有三个成员（DDX1，DDX3和DDX41）作为胞质感受器还参与了抗病毒的天然免疫反应。于是，作者希望能够找到其它参与mRNA剪接且在核内影响宿主抗病毒反应的DDX家族成员。作者将DDX家族的7个成员（DDX5，17，23，39，42，46和48）作为候选，应用siRNA敲低其表达，发现只有敲低DDX46表达才能显著增加VSV病毒感染后干扰素的产生。为进一步揭示DDX46功能，作者应用CLIP测序，发现DDX46与抗病毒基因（Mavs，Traf3和Traf6）通过与共有保守结构域CCGGUU结合而起作用。在分子机制上，作者以去甲基化酶ALKBH5为研究对象，应用RIP测序，发现感染病毒后细胞核内DDX46与ALKBH5结合显著增加，使得与DDX46结合的抗病毒效应分子mRNA发生去甲基化修饰，导致复合物在核内滞留，抑制了抗病毒效应分子蛋白的表达，从而降低干扰素产生，最终抑制抗病毒天然免疫应答反应。
图1. RIP测序检测感染DDX46与ALKBH5结合的增加
2. Nature Microbiology：HIV病毒感染促进自身及宿主淋巴细胞的m6A RNA甲基化
2016.2.22
同样来自Nature的子刊，加州大学圣地亚哥医学院Tariq团队利用HIV感染CD4淋巴细胞（该细胞为艾滋病病毒的主要攻击对象），在病毒感染增殖期（感染后第3天）取样进行实验。作者应用m6A RNA甲基化测序和northern blot技术结合， 证实HIV-1病毒感染淋巴细胞后，不管是病毒自身的RNA，还是宿主细胞的RNA，能促进RNA的甲基化反应。研究团队应shRNA，在CD4 T淋巴细胞敲低m6A甲基转移酶METTL3和METTL14，发现HIV-1的复制受到抑制，在敲低甲基转移酶ALKBH5，发现促进了HIV的复制。作者通过m6A RNA甲基化测序，检测到HIV RNA上有14个m6A甲基化peak，接着再应用m6A RNA甲基化测序，在受感染CD4 T淋巴细胞中筛选到56个因m6A甲基化修饰而差异表达的转录因子，GO分析表明这些转录因子和病毒基因的表达调控有密切关系。为了进一步研究病毒RNA甲基化位点功能，作者在第11个peak的茎环结构IIB区将A7877和A7883位点做甲基化处理，发现人类和病毒RNA中m6A修饰促进Rev蛋白和RRE RNA的结合，从而调控RNA出核。
图2. HIV-1病毒感染CD4 T淋巴细胞后m6A修饰的作用机制
3. Cell Host & Microbe：m6A RNA甲基化修饰调控黄病毒感染
影响因子：14.9，2016.11.9
杜克大学医学院Stacy研究团队研究了m6A RNA甲基化修饰对丙型肝炎病毒（HCV）感染的影响。他们发现，在Huh7细胞内利用siRNA敲低甲基转移酶METTL3和METTL14后，HCV的非结构蛋白NS5A的表达明显升高，当敲低去甲基化酶FTO后，NS5A蛋白表达明显降低。由于NS5A蛋白与HCV的复制密切相关，以上研究表明m6A相关的酶系统调控HCV感染。研究人员还发现，YTHDF蛋白可以识别HCV RNA，并负调控HCV子代病毒的产生。由于HCV病毒的复制主要位于细胞内的脂质体内，他们利用免疫荧光技术对HCV感染的细胞内的YTHDF蛋白进行了定位，发现HCV感染诱导YTHDF蛋白向脂质体的定位，识别并结合HCV RNA，还在其他黄病毒属病毒包括登革病毒（DENV2）、黄病毒（YFV）、寨卡病毒（ZIKV）和西尼罗病毒（WNV）中也应用m6A RNA甲基化测序检测到m6A修饰位点。综上，本研究发现细胞质内复制的HCV病毒存在m6A修饰，在病毒的生命周期内扮演重要角色，这也为黄病毒属疫苗的研究提供了新的切入点。
图3.黄病毒属病毒m6A RNA修饰调控病毒感染机制
4.Cell Host Microbe：寨卡病毒感染过程中病毒及宿主的m6A RNA甲基化修饰的动态变化
影响因子：14.9，2016.11.9
加州圣地亚哥大学学者发现m6A甲基化不但影响寨卡病毒自身的转录，还影响宿主RNA的结构和功能，并阐明了相关作用机制。作者首先应用m6A RNA甲基化测序，检测到m6A在寨卡病毒中高表达。接着，在293T细胞内利用shRNA敲低甲基转移酶METTL3和METTL14以及去甲基化酶ALKBH5和FTO后，应用RIP测序和Real-time PCR结合，检测寨卡病毒体内RNA表达量，以上研究表明m6A相关酶系统调控m6A的甲基化与去甲基化，从而负调控病毒的复制。作者应用敲降技术，敲低YTHDF1-3蛋白的表达，发现任意单独敲除一种蛋白后，都可促进寨卡病毒的复制，并且敲低YTHDF 2蛋白后，对病毒复制的促进作用最强。为验证敲降结果，作者构建YTHDF1-3蛋白与pcDNA的重组质粒，分别转染至293T细胞，发现病毒的复制受到抑制，并且YTHDF 2的抑制作用最强。敲降和过表实验共同说明，YTHGF 1-3参与了寨卡病毒感染的过程，并且YTHGF 2蛋白作用最显著。为进一步研究YTHGF 2蛋白作用机制，作者应用WB技术，检测到YTHGF 2在敲低METTL14或ALKBH5的细胞中高表达，并应用RT-qPCR技术，检测到敲低ALKBH5后，能显著促进病毒复制，而METTL14抑制病毒复制，说明ALKBH5通过直接结合YTHGF 2，参与病毒复制过程。总体来说，本研究揭示了受寨卡病毒感染宿主细胞内m6A相关酶的作用机制。
图4.宿主体内寨卡病毒的作用机制
5. eLIFE：m6A RNA甲基化调控HIV-1病毒感染和Gag蛋白表达
影响因子：7.7，2016.7.2
与加州大学一样，来自俄亥俄州立大学团队也研究了HIV-1 RNA m6A修饰与病毒感染和基因表达的关系。作者应用RIP测序和m6A RNA甲基化测序，发现HIV-1感染CD4 Jurkat细胞，CD4 T淋巴细胞或293T细胞后，发现m6A在细胞间的修饰位置相似，主要分布在基因组非编码区。接着，作者应用CLIP和m6A RNA甲基化测序，检测过表达HIV-1病毒后，Hela或CD4细胞中YTHDF1-3蛋白的表达量，旨在检测YTHDF蛋白是否能与病毒的m6A位点结合。结果发现三种YTHDF蛋白都可识别并结合HIV-1 RNA中的m6A修饰位点。那么既然蛋白和位点是能够结合的，那么它们之间是在何处，在何时，又发挥着何种功能呢？作者接着在人类癌症细胞系中应用过表达和敲降技术做功能验证，证实YTHDF蛋白在HIV-1病毒复制过程中发挥负调控作用。并且，抑制蛋白表达后，病毒Gag蛋白的表达明显抑制，而通过敲降去甲基化酶AlkBH5，FTO或共抑制后，病毒Gag蛋白的表达明显升高。
图5. YTHDF蛋白负调控HIV-1病毒表达
6. PLoS Pathogens：m6A RNA甲基化影响不同类型细胞感染Kaposi肉瘤病毒后的调控模式
影响因子：6.6，2018.4.16
伯克利大学Britta团队首次揭示了感染Kaposi肉瘤病毒（KSHV）后，细胞中m6A的分布情况，发现YTHDF2蛋白在核内发挥作用。作者应用超高液相色谱法，发现受KSHV病毒感染的iSLK 219细胞（是研究病毒裂解细胞的模式细胞），其RNA m6A甲基化位点修饰比对照组高3倍，说明病毒感染细胞可促进m6A甲基化的修饰。作者通过m6A RNA甲基化测序研究病毒裂解宿主细胞期间细胞RNA中m6A的表达量，发现m6A甲基化程度与细胞裂解程度呈成反比。为验证m6A RNA甲基化测序结果，作者应用RIP测序和Real-time PCR技术检测一条与抗病毒相关通路上6个基因的结合和表达量，发现该通路的确参与了KSHV病毒的表达，与m6A RNA甲基化转录组功能预测的结果一致。作者假设m6A在KSHV病毒生命周期中起关键作用。通过siRNA敲低iSLK 219和iSLK BAC 16细胞中METTL3或YTHDF1-3蛋白的表达，使分别其感染正常293T细胞，发现病毒的复制受抑制，并且病毒裂解反式激活因子ORF50也受到了抑制。通过对比两种细胞的m6A分布，作者发现在iSLK 219细胞中，m6A主要调控前病毒模式，而在iSLK BAC 16细胞中，m6A主要调控后病毒模式。综上，本研究证实了m6A参与了病毒感染的通路，并且在不同的细胞类型中差异很大。
图6. KSHV病毒感染iSLK 219细胞检测m6A RNA修饰实验步骤
云序相关产品推荐：
m6ARNA甲基化测序
m5CRNA甲基化测序
m1ARNA甲基化测序
RIP测序
RNA Pull Down
往期精彩回顾 ：
最新云序生物m6A“RNA甲基化”研究汇总-癌症篇
NEW！国内首篇10分以上m6A RNA 甲基化测序文章---云序生物助力！
云序生物独家首发m5C RNA甲基化测序
2018国自然研究热点二：RNA甲基化研究深度剖析
如何利用RNA甲基化测序数据发表10分文章
上海云序生物科技有限公司
Shanghai Cloud-seq Biotech Co.,Ltd
地址：上海漕河泾高新技术开发区钦州北路1066弄
电话：021-64878766
网站：www.cloud-seq.com.cn
邮箱：market@cloud-seq.com.cn
