免疫球蛋白提取技术
免疫球蛋白提取技术
实验方法原理 |
随着免疫学的发展和需要,免疫球蛋白的纯化和其成分的提纯成为必不可少的手段。纯化的方法很多,有单一法,但大多数采用二步法以上相结合的方法,特别是以硫酸铵提纯为基础,再经过层析柱的方法来提高免疫球蛋白及其各成分的纯度最为常用。 硫酸铵溶液能使蛋白质胶体脱水并中和其电荷而使之沉淀下来(称为盐析)。不同浓度的硫酸铵盐析蛋白成分不同,利用这一原理提取所需的免疫球蛋白成分。盐析只能粗提,为了获得纯化的免疫球蛋白成分,必须进一步采用层析的方法进行分离。 免疫球蛋白包括IgG、IgM、IgA、IgE和IgD。 |
---|---|
实验材料 | 动物血清 初乳 胆汁 |
试剂、试剂盒 | 硫酸铵 NH4OH PBS NaH2PO4 NaH2PO4 2H2O BaCl2 HgI KI HCl NaOH PB DEAE52 葡聚糖凝胶G200 无水硫酸钠 硼酸盐缓冲液 |
仪器、耗材 | 离心机 透析袋 低温冰箱 电泳槽 电泳仪 |
实验步骤 |
1.取20ml血清,加生理盐水20ml,再逐滴加入(NH4)2SO4饱和溶液10ml,使成20%(NH4)2SO4溶液,边加边搅拌,充分混合后,静置30min。 2.3000r/min离心20min,弃去沉淀,以除去纤维蛋白。 3.在上清液中再加(NH4)2SO4饱和溶液30ml,使成50%(NH4)2SO4溶液,充分混合,静置30min。 4.3000r/min离心20min,弃上清。 5.于沉淀中加20ml生理盐水,使之溶解,再加(NH4)2SO4饱和溶液10ml,使成33%(NH4)2SO4溶液,充分混合后,静置30min。 6.3000r/min离心20min,弃上清,以除去白蛋白。重复步骤5,2——3次。 7.10ml生理盐水溶解沉淀,装入透析袋。 8.除盐,在常水中透析过夜,再在生理盐水中于4℃透析24h,中间换液数次。 以1%BaCl2检查透析液中的SO42-或以纳氏试剂检查NH4 (取3——4ml透析液,加试剂1——2滴,出现砖红色即认为有NH4 存在),直至无SO42-或NH4 出现为止。也可采用SephadexG25或电透析除盐。 9.离心去沉淀(去除杂蛋白),上清液即为粗提IgG (即γ球蛋白,如以36%的饱和硫酸铵沉淀血清的产物即为优球蛋白,Euglobin,含γ球蛋白)。 10.过DEAE——纤维素层析柱。(装柱过程见层析技术)。以0.01Mol/L pH7.4PBS(0.03Mol/L NaCl)洗脱,收集洗脱液。 也可采用SephadexG150或G200柱。 11.蛋白质及其定量鉴定。 12.IgG的纯度鉴定,可采用下列方法之一鉴定。 ①玻片琼脂或醋酸纤维膜电泳均可 加样电泳后,只在γ—球蛋白的迁移部位出现一条带。操作时,同时可用全血清样品,不同浓度(NH4)2SO4盐析样品进行电泳,以资比较。 ②琼脂双相双扩散鉴定 预先准备该IgG免疫异种动物所获的抗IgG血清。将IgG与抗IgG血清进行双相双扩散,如IgG提纯的话,则在两样品孔之间出现一条沉淀线。 ③免疫电泳鉴定 孔内加待测样品,电泳后,在槽内加抗IgG血清,琼脂扩散24h,观察结果。如果提取的IgG纯的话,则只出现一条弧形的沉淀线,且沉淀线位于γ—球蛋白区。此鉴定必须同时进行全血清及抗血清抗体的免疫电泳,以资比较。 ④圆盘电泳鉴定 用全血清样品及提纯样品同时进行圆盘电泳。全血清样品在圆盘电泳上出现数十条区带,而纯化的IgG则只有一条区带。 13.IgG的浓缩与保存 ①IgG的浓缩 ②IgG的保存 一般浓缩至1%以上的浓度,再分装成小瓶冻干保存,或加0.01%硫柳汞在普通冰箱或低温冰箱保存,注意防止反复冻融。
展开 |
注意事项 |
材料准备与试剂配制 1.动物血清 2.硫酸铵饱和溶液 硫酸铵800g~850g H2O 1000ml 加热至绝大部分溶质溶解为止,趁热过滤,置室温过夜,然后以28%NH4OH调pH至7.0(不调pH值也可以)。 注:硫酸铵以质量优者为佳,因次品中含有少量重金属对蛋白质巯基有影响。如次品必须除去重金属,可在溶液中通入H2S,静置过夜后滤过,加热蒸发H2S即可。 3.0.01Mol/L pH7.4PBS液 A液:0.10Mol/L NaH2PO4液 NaH2PO4•;2H2O 15.60g 加H2O至1000.ml B液:0.10Mol/L Na2HPO4液 Na2HPO4•12H2O 35.80g 加H2O至1 000ml 取A液19ml,B液81ml加水至1000ml即可。 4.1%BaCl2溶液 5.纳氏液 HgI 115.00g KI 80.00g 加H2O至500.00ml 溶化后过滤,然后再加20%NaOH500.00ml,混合即可。 6.0.50 Mol/L的HCl液和0.50 Mol/L的NaOH液。 7.洗脱液:0.03Mol/L的NaCl液。 8.透析袋(或玻璃纸)。
展开 |
其他 |
应用硫酸铵盐析及DEAE-纤维素层析法提纯化的IgG,不仅操作复杂、需时较长,处理过程中样品体积大大增加,而且透析时变性严重,容易引起抗体效价降低等。为了克服这一不足,特别是当大量提取IgG时,则往往采取下列的简易办法。 1.DEAE-纤维素直接提取法 取样品直接过DEAE-纤维素柱。下面介绍的是最为简单的烧杯法。 ①以一定数量的DEAE52放入烧杯中,加入0.01Mol/L pH8.0PBS缓冲液,静置30min,去上清细粒,再重复一次。 |