逆转录 PCR的定义和主要影响因素介绍
逆转录 PCR（Reverse TranscriptionPCR, RT-PCR）是一种以 RNA 为样本，RNA链被逆转录成为互补 DNA（cDNA），再以此为模板通过 PCR 进行 DNA 扩增。在实际应用中，RT-PCR 分为一步法 RT-PCR 和两步法 RT-PCR。整个反转录实验过程有三个重要的因素，分别是RNA模板、反转录时所使用的引物类型、反转录酶 。
RNA模板
高质量的 RNA 基本有几个参数可供参考，首先是 OD260/280 以及 OD260/230的值应该都是 2.0 左右，如果 OD260/280 小于 1.9，说明 RNA 中有一些蛋白质的残留，如果这个值大于 2.1，则很可能样本中 RNA 有一定的降解。OD260/230如果小于 2.0，说明 RNA 中含有异硫氰酸胍，酚残留，而这些物质对逆转录反应影响是非常大的。另外就是琼脂糖凝胶电泳检测 RNA 的完整性，正常的 RNA一般呈现三条带，即 5s、18s、28s，其各自的亮度呈现递增状态，依据物种不同可逆转录 PCR能存在些许差异。当 RNA 出现降解时，反馈最明显的是 5s rRNA 的亮度显著提高。上图展示的分别是高质量 RNA、稍有降解以及完全降解的实例。
5s rRNA 的亮度
提取到了高质量的 RNA模板后，下一个需要考虑的问题便是引物的选择了。通常，反转录引物有三类，分别是 oligodT、随机引物和序列特异性引物：oligodT引物能特异性结合在含有 polyA 尾的 mRNA 末端起始反转录反应，但这一特性决定了它只能扩增含有 polyA 尾的 mRNA，而且对 RNA 模板的质量要求较高，一旦 polyA 尾发生降解，就不能被引物所识别，从而导致产物中没有相应基因的cDNA；随机引物一般含有 6-9 个随机序列的碱基，能够随机识别结合在 RNA 模板上，因此这类引物的优点在于能同所有类型的 RNA 结合，而且比较适合于含有二级结构的 RNA 及微量样本，具有较高的反转录灵敏度。
但缺点在于，结合的随机性会造成 cDNA小片段较多，有时候还会对微量目的片段造成稀释；序列特异性引物，顾名思义，针对于特定的序列设计的反转录引物，用于特异性的反转录某一段序列。在实际的应用中，我们通常会研究同一个个体或细胞中不同基因表达水平的变化，因此序列特异性基因相对用的少一些。Solis BioDyn 可供的反转录预混液中可提供多种不同的引物（oligodT、随机引物、以及 oligodT 与随机引物的结合）供您选择，满足您的一切实验需求！
逆转录酶
Solis BioDyn 可提供两种逆转录酶：分别是 MMLV（RNase H+）和 SOLIScript（RNase H-）逆转录酶。RNase H，是一种核糖核酸内切酶，可以特异性地水解DNA-RNA 杂合链中的 RNA，不能水解单链或双链 DNA 或 RNA。
