利用 DNA 混编模仿自然进化过程是优化 DNA 和蛋白质性质的常用方法。这里我们介绍这类方法的一个新进展，即利用标准的聚合酶链反应（PCR)放大基因文库时与其他 4 种标准 dNTP—起掺入 dUTP 作为确定 DNA 碎裂位点的交换核苷酸。本实验来源「现代蛋白质工程实验指南」〔德〕K.M.阿恩特、K.M.米勒编著。
| 实验材料 | T4 DNA 连接酶感受态细胞 |
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| 试剂、试剂盒 | Taq 聚合酶PCR 缓冲液溴化乙锭（EB) 溶液过硫酸铵（APS) 水溶液 |
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| 仪器、耗材 | 琼脂糖凝胶 |
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| 实验步骤 | 3.1 克隆
NExT 混编过程中，使用包含限制性酶切位点的混编引物的配对位点应设置在紧挨着目标基因的两侧，理想的退火温度为 60°C 左右。通过 4 加 2 法则估算引物的退火温度：每个 G 碱基和 C 碱基为 4°C，A 碱基和 T 碱基为 2°C。
我们在 NEXT 混编过程中使用的基因包括：含 657 个碱基的野生型 CAT 基因 ( CATwt；SwissProt 编号： P00 483；蛋白质数据库（PDB) 编号：1NOC：B)，编码 N 端 10 个残基截短的突变体，C 端 9 个碱基截短和 N 端、C 端双截短 CAT 突变体 ( CAT_Nd10，CAT_Cd9 和 CAT_ Nd10_Cd9 ) 以及 C 端 26 个碱基截短突变体( CAT_Cd26)。这些基因和全部的混编基因都克隆到质粒载体 PLiSC-SAFH1 上[7]，使用 Xba l 和 Hind III 双酶切位点替换原始质粒的部分片段。多样性的产生则通过易错 PCR 和尿苷酸交换 PCR ( 见 10.3.2 节）。扩增野生型和 N 端截短的基因使用 Pr-Nshuffle ( 5'- ATTTCTAGATAACGAGGGCAA-3' ) 和 Pr-C-shuffle ( 5’- ACTTCA CAGGTCAAGCTTTC-3'）混编引物；而对于扩增 C 端截短和双截短突变体的基因则使用 Pr- N-shuffle 和 Pr-Cdx-shuffle (5’-CTTCACAGGTCAAGCTTATCA-3’）引物。通过常规方法将这些质粒转化到大肠杆菌感受态细胞中 [8]。
3.2 尿苷酸交换 PCR
选择尿苷酸作为交换核苷酸，因为许多种 DNA 聚合酶都可将 dUTP 引入基因序列 [9]。尿苷酸交换 PCR 在扩增目标基因库的同时，也引入了交换核苷酸，尿苷酸。通过改变 dUTP: dTTP 的比率可获得理想的 DNA 断裂效果。这一步骤的实现即可通过分析不同 U:T 比率的实验，详见 10.3.4 节，也可使用我们为此目的开发的程序（见 10.3.9 节）。使用高达 50% 比率的 dUTP 并不影响 PCR 产物的得率。只有在完全使用 dUTP 的情况下，PCR 产物的产量大约为其他反应的 1/4 ( 图 10.1A )。
( 1 ) 为精确加样量，将 100 mmol/L 核苷酸储液用水稀释到 dATP、dGTP 和 dCTP 的终浓度为 10 mmol/L ，dUTP 和 dTTP 终浓度 1 mmol/L。
( 2 ) 尿苷酸交换 PCR 混合液包括：50 ng 模板（对含 4340 个碱基的质粒为 0.017 pmol)，引物各 25 pmol，dATP、dGTP 和 dCTP 各 0.4 mmol/L，0.4 mmol/L dUTP : dTTP 不同比率的混合物，5U Tag DNA 聚合酶，5 μl 10 X PCR 缓冲液。用水加至终体积 50 μl ( 见注 1 和注 2 )。
( 3 ) 温度循环程序为 94°C 预变性 1 min；92°C 变性 30s，62°C 退火 20s，72°C 延伸 2 min，共计 25 个循环；最后 72°C 再延伸 4 min。其中将延伸时间延长至 2 min 是因为测试表明这样可以显著的提高产量（数据略去）。根据 PCR 的不同产量，需同时做 4 个或更多的 50 μl 反应体系以获得足够的产物（胶回收后应最好约为 7 μg DNA；见注 3 )。
( 4 ) 将得到的 PCR 产物合并，并通过 1% 的琼脂糖凝胶电泳分离纯化（见注 4)。如果量足够多的话，在日光下即可从胶上看到浅红色的条带。将条带切割下来后加到一两个胶回收试剂盒的离心柱中，用 50 μl 洗脱缓冲液洗脱。
( 5 ) 使用波长范围 220~350 nm 的分光光度计检测 260 nm 的基线校准吸光值，测定 PCR 回收产物的浓度。我们通常以 1 : 30 稀释后在 140 μl 的比色杯中测量。NExTDNA 混编产物最理想的得率为 7 μg DNA。更低的得率可能也行，但足够量的 DNA 可确保下一步的基因重组顺利进行（见 10.3.7 )。将所有理想的 DNA 都用于下步反应。
在这项研究中，我们均使用尿苷酸作为交换核苷酸，然而此项技术也同样适用于其他类似物的引入。例如，8- 氧化鸟嘌呤（8- oxoguanine) 可被 8-氧化鸟嘌呤 DNA 糖基化酶 FPG ( foramidopyrimidine-DNA glycosylate) 切除 [ 10 ]。该减基可用于 AT 富集区，那里 UDG 酶频繁的切割 DNA，也可用于缺少胸腺嘧啶的 GC 富集区。因此，将多种交换核苷酸结合在一起使用可以产生所需大小的片段，用于下一步的再组装。另外，在 PCR 引物中引入交换核苷酸应确保基因库中的这些区域同样被混编。
3.3 酶解反应和化学切割
将尿苷酸交换 PCR 纯化后的产物进行 UDG 酶解反应，在交换核苷酸位置切割 DNA。该酶对双链和单链 DNA 均有效，通过对双脱氧尿苷 C1' 位点的亲核攻击引发水解反应，高特异的去除尿嘧啶基团 [12] 。哌啶用于经 UDG 酶切割去除尿嘧啶后的骨架部分 [13]。通过高分辨率尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析上述切割反应的结果，其中 dUTP 的比率从 100% 到 0% 不等（图 10.1B )，进而再用图像分析软件定量（图 10.1C)。对于很小的片段，可通过引入放射性标记来更好地观测（见注 2 )。
( 1 ) UDG 酶解反应体系包括 45 μl PCR 纯化产物（含约 7 μg DNA，见 10.3.2 节步骤 4)，6 μl 10 X UDG 反应缓冲液，2 U 大肠杆菌 UDG 酶。加水至 60 μl，37°C 消化 1 h ( 见注 6 )。
( 2 ) 使用哌啶切割 DNA 反应体系包括终浓度为 10% ( m/V ) 的哌啶（60 μl 体系中加 6.7 μl 哌啶储液），在有加热盖子的热循环仪中 90°C 反应 30 min ( 见注 7)。
作为采用相对温和的反应条件的尝试，用其他的一些内切核酸酶替代哌啶切割骨架 DNA [11]，如内切核酸酶 IV [ 14 ] ，核酸外切酶 Ⅲ [15]，或 T4-内切核酸酶 V [16] 。我们检测了最后一种但否定了其使用。T4 内切核酸酶 V 切割 UDG 作用后的 DNA 结果得到的是不完全断裂，这从产物的大小分布可见（图 10.2A )。更麻烦的是这一反应必将引起高错误率的出现。应用 UDG 和 T4 内切核酸酶 V 切割 CAT 野生型基因，胶回收后进行重组装，送其中的 6 个克隆共计 3930 bp 去测序，结果突变率为 1.75%。对于这一结果我们给出了两个原因。首先，T4 内切核酸酶 V 是通过其裂解酶活性切割 DNA 骨架，其间催化了一个 β 消除反应，留下了 3' 端不饱和的醛基（4-羟基-2-戊醛）连在磷酸基团上 [ 11，17] 。进一步生成游离磷酸基的化学反应并未完成，如此产生的片段不利于聚合酶的起始。其次，通过片段比较发现，不是所有引入尿苷酸位点的骨架都完成了切割。但这些位置的尿嘧啶都被切掉了，这种碱基缺失的模板会造成错误核苷酸的引入。Miyazaki [18] 建议使用大肠杆菌内切核酸酶 V，但从提供的数据可见，切割的效率更低，即使延长切割时间（12 h) 并提高 dUTP 的比率（75% ) 仍不能获得短的片段。虽然可以设计进一步的实验解决这些问题，但因哌啶的切割即好又划算，就没有必要再做尝试。
作为哌啶的化学替代品，我们检测了氢氧化钠的效果。将哌啶储液替换为 0.5 mol/L 氢氧化钠溶液，加至 DNA 体积的 10% ( V/V ) ，90°C 反应 30 min。使用哌啶和氢氧化钠切割相同的尿苷酸交换 PCR 产物，比较二者变性聚丙烯酰胺凝胶电泳后 EB 染色的结果。通过图像分析软件，得到的断裂片段的强度分布基本一致。平行进行的重组装反应也得到了相似的结果。这些都证明了哌啶引发的主要反应是碱催化的 β 消除反应，将两个余下的磷酸基从 DNA 的糖基上去除下来。因此，如果非常重视安全因素，可用氢氧化钠替代哌啶。然而我们未测序分析氢氧化钠切割片段重组装后的产物是否产生突变。原则上，哌啶更适合引发糖基上的亲核攻击，切割的效果也更为彻底。
3.4 尿素变性聚丙酰胺凝胶电泳
使用尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析断裂片段的大小分布并纯化特殊大小范围的片段（见 10.3.5)。此步为备选步骤，仅对要求严格控制的断裂反应推荐使用。
( 1 ) 凝胶包含 6.7 mol/L 尿素，11%~12% 的聚丙烯酰胺和 1 X TBE 缓冲液 [8] 。分析胶的大小为 10cm X 8cm X 1mm，制备胶的大小为 10cm X 8cm X 2mm (见 10.3.5.2 )。因尿素降解会影响电泳效果，故要求所有的凝胶都新鲜制备。我们通常使用 31.5 g 尿素，29.2 ml 包含 30% 聚丙烯酰胺，0.8% 甲叉双丙烯酰胺（37.5 : 1 ) 的凝胶储液，17.1 ml 水，7.5 ml 10 X TBE 缓冲液，500 μl 10% APS 水溶液和 50 μl TEMED；这些足够在一个制胶器中同时制备 9 块分析胶（见注 8 )。
( 2 ) 电泳在 56°C 进行。我们使用 Hoefer Mighty 小型基础电泳槽（Amersham)，配接温度控制水浴锅。
( 3 ) 在 1 X TBE 缓冲液中将凝胶预电泳 10 min，电压 100V。
( 4 ) 将断裂 DNA 浓缩至 7 μl，加至 speed-vac 真空离心挥发哌啶，加 25 μl 去离子甲酰胺，在 PCR 仪中 80°C 加热 3 min ( 见注9 )。再加入 3 μl 60% 的蔗糖溶液和 7 μl 水帮助上样（见注 10)。最终上样量为 15~20 μl ( 约含 3 μg DNA ) 。
( 5 ) 寡核苷酸混合液和 100 bp DNA 标尺可作为分子质量标准（见注 11) 。至少一个标尺使用带染料的上样缓冲液。
( 6 ) 上样后 170 V 进行电泳，至标尺中的溴酚蓝距边缘还有 0.5 cm 时结束（见注 12 ) 。
( 7 ) 在 30 ml 1 μg/ml 的 EB 溶液（1 : 5000 稀释）中染色 5 min，紫外灯下观察（见注 13 ) 。
分析型凝胶电泳结果表明，断裂产生片段的大小分布具有固定的峰值，由 dUTP 所占的比率决定。如图 10.1B 所示，多个长度分布带很容易得到，包括很小的和大的片段，分别适用于短的基因和长基因簇的混编。这样的测试只用于最初确定合适的 dUTP 比率以获得目标的片段大小分布。最后确定测试库中 dUTP 使用的最佳比率为 33.3%，且结果的重复性很好。因此，在接下来的定向进化实验中，此步分析电泳可以省略。
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