利用核苷酸交换和剪切技术进行DNA碎裂和定向进化实验 2
3.3 酶解反应和化学切割
将尿苷酸交换 PCR 纯化后的产物进行 UDG 酶解反应，在交换核苷酸位置切割 DNA。该酶对双链和单链 DNA 均有效，通过对双脱氧尿苷 C1' 位点的亲核攻击引发水解反应，高特异的去除尿嘧啶基团 [12] 。哌啶用于经 UDG 酶切割去除尿嘧啶后的骨架部分 [13]。通过高分辨率尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析上述切割反应的结果，其中 dUTP 的比率从 100% 到 0% 不等（图 10.1B )，进而再用图像分析软件定量（图 10.1C)。对于很小的片段，可通过引入放射性标记来更好地观测（见注 2 )。
( 1 ) UDG 酶解反应体系包括 45 μl PCR 纯化产物（含约 7 μg DNA，见 10.3.2 节步骤 4)，6 μl 10 X UDG 反应缓冲液，2 U 大肠杆菌 UDG 酶。加水至 60 μl，37°C 消化 1 h ( 见注 6 )。
( 2 ) 使用哌啶切割 DNA 反应体系包括终浓度为 10% ( m/V ) 的哌啶（60 μl 体系中加 6.7 μl 哌啶储液），在有加热盖子的热循环仪中 90°C 反应 30 min ( 见注 7)。
作为采用相对温和的反应条件的尝试，用其他的一些内切核酸酶替代哌啶切割骨架 DNA [11]，如内切核酸酶 IV [ 14 ] ，核酸外切酶 Ⅲ [15]，或 T4-内切核酸酶 V [16] 。我们检测了最后一种但否定了其使用。T4 内切核酸酶 V 切割 UDG 作用后的 DNA 结果得到的是不完全断裂，这从产物的大小分布可见（图 10.2A )。更麻烦的是这一反应必将引起高错误率的出现。应用 UDG 和 T4 内切核酸酶 V 切割 CAT 野生型基因，胶回收后进行重组装，送其中的 6 个克隆共计 3930 bp 去测序，结果突变率为 1.75%。对于这一结果我们给出了两个原因。首先，T4 内切核酸酶 V 是通过其裂解酶活性切割 DNA 骨架，其间催化了一个 β 消除反应，留下了 3' 端不饱和的醛基（4-羟基-2-戊醛）连在磷酸基团上 [ 11，17] 。进一步生成游离磷酸基的化学反应并未完成，如此产生的片段不利于聚合酶的起始。其次，通过片段比较发现，不是所有引入尿苷酸位点的骨架都完成了切割。但这些位置的尿嘧啶都被切掉了，这种碱基缺失的模板会造成错误核苷酸的引入。Miyazaki [18] 建议使用大肠杆菌内切核酸酶 V，但从提供的数据可见，切割的效率更低，即使延长切割时间（12 h) 并提高 dUTP 的比率（75% ) 仍不能获得短的片段。虽然可以设计进一步的实验解决这些问题，但因哌啶的切割即好又划算，就没有必要再做尝试。
作为哌啶的化学替代品，我们检测了氢氧化钠的效果。将哌啶储液替换为 0.5 mol/L 氢氧化钠溶液，加至 DNA 体积的 10% ( V/V ) ，90°C 反应 30 min。使用哌啶和氢氧化钠切割相同的尿苷酸交换 PCR 产物，比较二者变性聚丙烯酰胺凝胶电泳后 EB 染色的结果。通过图像分析软件，得到的断裂片段的强度分布基本一致。平行进行的重组装反应也得到了相似的结果。这些都证明了哌啶引发的主要反应是碱催化的 β 消除反应，将两个余下的磷酸基从 DNA 的糖基上去除下来。因此，如果非常重视安全因素，可用氢氧化钠替代哌啶。然而我们未测序分析氢氧化钠切割片段重组装后的产物是否产生突变。原则上，哌啶更适合引发糖基上的亲核攻击，切割的效果也更为彻底。
3.4 尿素变性聚丙酰胺凝胶电泳
使用尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析断裂片段的大小分布并纯化特殊大小范围的片段（见 10.3.5)。此步为备选步骤，仅对要求严格控制的断裂反应推荐使用。
( 1 ) 凝胶包含 6.7 mol/L 尿素，11%~12% 的聚丙烯酰胺和 1 X TBE 缓冲液 [8] 。分析胶的大小为 10cm X 8cm X 1mm，制备胶的大小为 10cm X 8cm X 2mm (见 10.3.5.2 )。因尿素降解会影响电泳效果，故要求所有的凝胶都新鲜制备。我们通常使用 31.5 g 尿素，29.2 ml 包含 30% 聚丙烯酰胺，0.8% 甲叉双丙烯酰胺（37.5 : 1 ) 的凝胶储液，17.1 ml 水，7.5 ml 10 X TBE 缓冲液，500 μl 10% APS 水溶液和 50 μl TEMED；这些足够在一个制胶器中同时制备 9 块分析胶（见注 8 )。
( 2 ) 电泳在 56°C 进行。我们使用 Hoefer Mighty 小型基础电泳槽（Amersham)，配接温度控制水浴锅。
( 3 ) 在 1 X TBE 缓冲液中将凝胶预电泳 10 min，电压 100V。
( 4 ) 将断裂 DNA 浓缩至 7 μl，加至 speed-vac 真空离心挥发哌啶，加 25 μl 去离子甲酰胺，在 PCR 仪中 80°C 加热 3 min ( 见注9 )。再加入 3 μl 60% 的蔗糖溶液和 7 μl 水帮助上样（见注 10)。最终上样量为 15~20 μl ( 约含 3 μg DNA ) 。
( 5 ) 寡核苷酸混合液和 100 bp DNA 标尺可作为分子质量标准（见注 11) 。至少一个标尺使用带染料的上样缓冲液。
( 6 ) 上样后 170 V 进行电泳，至标尺中的溴酚蓝距边缘还有 0.5 cm 时结束（见注 12 ) 。
( 7 ) 在 30 ml 1 μg/ml 的 EB 溶液（1 : 5000 稀释）中染色 5 min，紫外灯下观察（见注 13 ) 。
分析型凝胶电泳结果表明，断裂产生片段的大小分布具有固定的峰值，由 dUTP 所占的比率决定。如图 10.1B 所示，多个长度分布带很容易得到，包括很小的和大的片段，分别适用于短的基因和长基因簇的混编。这样的测试只用于最初确定合适的 dUTP 比率以获得目标的片段大小分布。最后确定测试库中 dUTP 使用的最佳比率为 33.3%，且结果的重复性很好。因此，在接下来的定向进化实验中，此步分析电泳可以省略。
3.5 片段纯化
经酶解和化学裂解得到的基因片段（见 10.3.3 ) 即可通过硅胶树脂直接从切割反应液中纯化（见 10.3. 5.1)，也可通过制备型尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化（见 10.3.5.2) 。
最初我们认为如想得到特定大小的片段必须通过凝胶电泳来纯化，以确保在重组装反应中没有较长片段甚或全长片段的参杂，以免影响碰撞概率。而实际上，如不经多轮的重组装反应，就无法从纯化的片段中直接扩增出全长产物，这表明切割反应进行的十分彻底（见 10.3.7) 。因此，只有对片段大小范围有十分严格的要求时才有必要 使用凝胶电泳纯化。
3.5.1 哌啶切割后直接纯化
( 1 ) 最简便的片段纯化方法就是使用 Qiaex II 试剂盒（Qiagen) 从哌啶切割后的反应液中直接纯化（见 10.3.3)。依据该试剂盒指南进行操作（见注 14)，加入结合缓冲液后中和（约 20 μl 3 mol/L 乙酸缓冲液）。
( 2 ) 清洗两次后，分两步加入 25 μl 洗脱缓冲液洗脱。将两次洗脱液混合。
( 3 ) 离心两次，每次换一个干净的离心管（见注 15)。
3.5.2 尿素变性聚丙烯酰胺凝肢电泳纯化
注意此步为可选步骤。尝试了两种方法从凝胶中回收片段。一种是经典的水提取后乙酸/镁离子沉淀法，另一种是使用 Qiagen 公司的 Qiaex II 试剂盒。但通过染色检测提取完基因后的凝胶，发现两者都存在提取不完全的问题。
( 1 ) 经制备型尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳后（见 10.3.4，步骤 1 ) ，在低强度紫外灯照射下将目标大小的条带切割下来（图 10.2B)。放入离心管中充分捣碎后加入提取缓冲液（QiaexII 提取，步骤 2 ) 或 1 ml 水（水提取，步骤 3 )，放入热混合器（Eppendorf ) 中以 37°C，1000 r/min 过夜孵育。
( 2 ) 如果使用 QiaexII 提取缓冲液提取，见 10.3.5.1 节。
( 3 ) 如使用水提取，加 1/10 体积的乙酸缓冲液，1/100 体积的氯化镁和 1 体积的异丙醇沉淀 DNA；-20°C 反应 1 h；4°C 20000 g 离心 15 min；将沉淀重悬在 50 μl 90% 乙醇中，放入热混合器中 37°C，1000 r/min 反应 1 h；-20°C 放置 1 h；4°C 20000 g 离心 15 mm；将沉淀在空气中晾干后，加入 30 μl 加入洗脱缓冲液，37°C，1000 r/min 孵育 1 h。
为得到胶提取步骤的交叉率，我们设计了 3 个母本克隆（CAT_Nd10 突变体）的混编检测实验。其中两个克隆在 100 bp 范围内包含 1 个特异的突变，另一个在 100 bp 范围内包含 2 个特异突变。混编并经 Tag 酶扩增后挑选 8 个克隆测序，结果表明其中的 6 个克隆在 100 bp 范围内有一个交叉。这与直接快速纯化得到的交叉率可比 （ 见 10.3. 5.1 和 10.3.8 )。实验共测序了 3851 个碱基，发现了 12 处错误，突变率为 0.31%。这样的错误率比快速纯化的错误率高很多，可能是由于 UV 照射（哪怕是弱的 366 nm 的光源）或是凝胶中的化学修饰引起的。因此我们在最终的 NExT DNA 混编方法中，去掉了凝胶纯化的步骤，因为额外的工作并未带来益处，反而损失了产量，提高了错误率。
