利用核苷酸交换和剪切技术进行DNA碎裂和定向进化实验 3
3.6 纯化片段的定量
为了分析和比较纯化得到的 DNA 的产量，我们首先使用 SYBR Greenn 试剂来定量。因为 NExT DNA 混编方法的重复率很髙，我们只定量一次即可（见注 16 )。通常我们都能获得浓度为 40~60 ng/μl 的 DNA 片段。
( 1 ) 取 2 μl 纯化的 DNA 片段（见 10.3.4)，加入 50 μl 1 : 5000 稀释的 SYBR GreenII 溶液染色，此染色液对单链 DNA 非常敏感（见注 17) 。
( 2 ) 在暗箱中反应 5 min 后检测荧光信号（我们使用 96 孔的 Perkin Elmer LS 50B 荧光粉光光度计；见注 18)。染料的激发波长是 480 nm，可在 515 nm 检测发射值。
( 3 ) 使用片段大小范围内的标准寡核苷酸，稀释不同的倍数绘制浓度标准曲线，标定片段所含 DNA 的浓度。
3.7 基因重组装和扩增
通过内部引物延伸反应从纯化的基因片段重组得到全长基因（见 10.3. 5)，其 间不断提高退火温度并最好使用具有校正功能的 DNA 聚合酶，如 Vent ( 图 10.3)。在内部引物延伸 PCR 过程中，片段之间可相互作为引物，因此每个循环反应后都会加长，直到最终得到全长基因。最后，通过常规 PCR 反应，加入两个末端引物对组装反应的产物进行扩增，构建克隆送测序。在方法建立过程中，通过琼脂糖凝胶电泳不断检测重组装反应结果（图 10.3 )。重组装反应在进行若干轮后停止，所得产物在此基础上进行 PCR 扩增。最后一步反应的基本原理与其他的基因组装进程相同，但有很重要的改变。尽管经历了剧烈的化学切割条件，使用了高保真 DNA 聚合酶的组装反应仍很高效。
( 1 ) 取出约 2 μg 的纯化 DNA 片段（见 10.3.5 ) 进行重组装。事实上如使用 Vent 聚合酶，少于 1 μg 的 DNA 片段都够用。通常我们都使用 20~25 μl 的片段溶液，无须检测浓度。
( 2 ) 在 DNA 片段中加入 4 μl ( 见注 19 ) 10 mmol/L 的 dATP、dTTP、d CTP 和 dGTP 的混合物（终浓度 800 μmol/L ) ，以及 4 U Vent DNA 聚合酶（NEB)，1~4 μl 25 mmol/L 的硫酸镁，5 μl 的 10X 反应缓冲液，加水定溶至 50 μl 。
( 3 ) 循环反应为 94°C 3 min；92°C 变性 30s，30°C 退火 60s，每轮增加 1°C ( 冷却率 1°C/s)，72°C 延伸 1 min，每轮多加 4s，共进 36 个循环；最终 72°C 再延伸 3 min。
( 4 ) 取重组装产物 10 μl ( 见注 20 ) 使用基因的合适引物（25 pmol 引物，0.2 mmo/L dNTP，25 个循环，40s 的延伸时间），进行常规 PCR 反应。
( 5 ) 使用适当的限制性酶切位点将扩增的基因克隆到载体上。
据我们所知，大多数已发表的片段重组装过程都使用 Taq 酶。Vent DNA 聚合酶的 3'→5' 校对核酸外切酶活性是基于其仅在 3' 端移除合成链上错配的核苷酸，直到聚合反应可以从退火的末端开始。这意味着核苷酸链上的点突变，即便是紧邻 3' 端的位置，都不会有问题 [19] 。为了比较这两种聚合酶的作用，分别使用 Tag 和 Vent 酶平行进行两组重组装实验，均使用相同的片段库作为起始。适量的重组装产物作为扩增 PCR 的模板，当使用 Taq 酶时，产物经琼脂糖凝胶电泳只有一条带，然后通过图像分析定量。结果，使用 Vent 酶的得到 DNA 产量为 Taq 酶的 35 倍。有意思的是，将使用 Tag 酶得到的 6988 个碱基测序，发现只有 5 个额外的突变（0.075% ) 。因此，在现有序列的统计误差内，使用 Tag 和 Vent 酶进行 NExT DNA 混编产生的错误率基本是相同的（见 10.3.8 )。关于两者产量的显著差别，可用校正酶的性质来解释。以 Vent 酶为例，该酶具有链置换活性 [ 20 ] ，这可能会帮助许多杂交反应的进行，另外 Vent 酶在 95°C 的半衰期约为 8 h，相对于 Tag 酶的 1.6 h [ 20 ] ，更适合长时间的重组装反应。另外，Taq 酶习惯在 3' 端多加额外的 dATP [21] ，这也是妨碍重组装反应进行的可能原因。除了上述因素，还发现 Tag 酶虽然适合片段的重组装反应，但其重组装的产物作为下一步扩增反应的模板，很难使用具有校正功能的 DNA 聚合酶进行扩增。
3.8 交叉率、片段的平均长度及突变率分析
将上面描述的 NExT DNA 混编技术应用在 600 bp 长的 CAT 基因的定向进化研究中，其中 N 端和 C 端分别截短 10 个和 9 个氨基酸残基（CAT_Nd10_Cd 9 ) 。实验中，挑选 12~383 碱基间具有不同突变模式的 5 个克隆与一个用于回交的截短野生型克隆相混合作为固定库，进行 33.3% 尿苷酸交换 PCR 来混编。从溶液中直接纯化片 段（见 10. 3.5.1 ) ，再经 Vent 聚合酶进行重组装反应（见 10.3.7 节）。在没有抗性选择压力的对照平板中挑选 8 个混编克隆进行测序（图 10.4A ) 。这些克隆独特的突变模式显示所有被检测的克隆都是从 2 ( 如克隆 1 ) ~4 个（如克隆 4 ) 母本克隆演化来的。在所涉及的 372 bp 的片段中，每 93~186 bp 就有一个交叉，平均片段长度为 114 bp。
通过测序结果计算突变率。在所测的 4425 个碱基中，发现了 4 个突变（一个 A 变为 G，一个 T 变为 C，1 bp 的插入和 1 bp 的缺失），计算突变率为 0.09%。这比之前报道的 DNA 酶混编的错误率 0.7% 要低得多。如 10.3.7 节中所述，并不是只有 Vent 聚合酶才能达到如此低的突变率。因为我们得到的片段大小分布和交叉率均与 DNA 酶混编的实验结果相当，因此分析前面报道的高错误率可能是由 DNA 酶解及凝胶观测时的紫外损伤引起的，而与片段大小和聚合酶种类无关。低突变率对长片段 DNA 的混编尤为重要，因为我们要尽可能地避免将功能异常的或不需要的分子引入基因库中。
进一步的实验中，挑选 4 个截短 CAT 基因（CAT_ Cd26 ) 母本进行了上述相同的混编实验，它们均包含一个突变，分布在 9~575 碱基，最终挑选 5 个克隆测序（图 10. 4B)。可检测的片段平均长度为 86 bp，其中包括许多短的片段。在 “对照 5”克隆中，突变位置分别相隔仅 6 个碱基（324 和 330 位置），12 个碱基（364 和 376 位置） 及 11 个碱基（404 和 415 位置）的突变体都被分开。这次实验得到片段的平均长度比之前的实验要小，这是因为更多的突变利于片段长度的检测。至于许多短片段的获得可能原因有两点：使用的 QiaexII 试剂盒可高效的回收短片段 DNA，或者基因扩增时的交叉是一个复杂的过程，包含如 PCR 基础上的链交换。
3.9 NEXT 片段断裂—预测程序
因为 dUTP 的掺入及产生的片段断裂都基于可推导的原则，我们开发了名为 NExTProg 的计算程序。该程序可预测双链 DNA 的 NExT 断裂模式，使得研究人员不需要实验就可设计合适的 dUTP: dTTP 比率。该程序通过读入 DNA 序列文件和 dUTP: dTTP 比值，就可算出所有可能的片段、它们出现的可能性及相对分布。给定 DNA 的互补链由程序自动生成并加入计算。计算后的结果以柱型统计图表形式显示，所有数据都可以列表形式输出以备使用（图 10. 5A ) 。当需要设定片段大小的上下限时（如凝胶纯化所需），程序可计算材料损失的可能性并调整每个片段的相对分布值。
3.9.1 数学原理
( 1 ) 设定给定 DNA 序列中的一个胸腺嘧啶被尿嘧啶替代的概率为 p。
( 2 ) 当两个胸腺嘧啶都被尿嘧啶替代时，就生成两者之间的片段，其概率为 p X p。
( 3 ) 只有当上述两个胸腺嘧啶间的 n 个胸腺嘧啶都不被替代时，片段才能存在，得到的概率为 p X p X ( 1-p）n。
( 4 ) 对于包含 1 个或 2 个 DNA 末端的片段，p X p 概率中的 1 个或 2 个 p 设为 1 ( 见注21)。
( 5 ) 为比较断裂结果，我们定义片段概率为除以所有值的和。
我们的计算方法与先前的计算都不同 [23]，因为我们考虑到片段的两个末端都需要产生，但不考虑诸如序列偏倚性和不确定的酶解条件等问题，这些会严重阻碍对 DNA 酶酶解的计算。
对于包含 x 个尿苷酸的基因，最多可产生可能片段 [ 根据高斯定理，当 x 为奇数时，等于（ x + 1 ) X （x + 2 ) / 2；见注 22 ]。因此，对于一个典型的包含 250 个胸腺嘧啶和 240 个腺嘌呤（在互补链中也计算为胸腺嘧啶）1000 bp 长的基因，很快程序计算产生 31626 + 29161 = 60787 个片段，包括它们的概率和序列。
因为大多数用户可能都对结果概貌感兴趣，该程序将所有具有相同大小的片段汇集在一起，将它们的概率加和，给出占所有概率加和的百分比对长度的分布，在程序中以 “％mol ”表示。为了将电泳条带可视化，通过某一片段的概率乘以其长度计算 “mass”分布。这些值被均一化，代表碱基比率，定义为 “ mass”，如在碱基对中固定长度，程序中显示为“ ％mass ”。片段序列的输出文件按出现可能性由大到小列出了所有的片段。同样的序列只列出一次，概率为它们的加和。
3.9.2 程序的校准及与实验结果的对比
在比较测量和计算的结果之前，有一个非常重要的值要考虑：就是交换 PCR 时聚合酶掺入尿苷酸对胸苷酸的比率。这个值可能不仅取决于 dUTP : dTTP 的值，也取决于使用的聚合酶类型、核苷酸的绝对浓度以及使用的缓冲液。因此当使用程序时，需要设定该值。尿苷酸的掺入量可用下列方法测量：直接的方法是通过放射性标记的 dUTP，计算 PCR 产物的放射能；间接的方法是定量分析断裂图谱。我们选择后者，因为它同时提供了与我们的软件相似的基本原则。但需要注意这种对资料的双重利用只有在断裂完全的情况下才有效。
为定量分析裂解实验，我们使用常用的条件（标准 Tag 聚合酶 [ 24 ] ，200 μmol/L dNTPs)。
( 1 ) 在尿苷酸交换 PCR 反应中（见 10.3.2，见注 2 ) ，使用 32P-dCTP 标记的 DNA。
( 2 ) 进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（见 10.3.4 ) 。
( 3 ) 通过成像仪对凝胶进行放射能成像（见注 23)。这避免了因小片段的低效染色造成的信号变形。
( 4 ) 将每条带都通过图像分析软件，如 QuantityOne ( BioRad ) 或 NIH Image/Scion Image/imagej ) 生成线密度曲线。
( 5 ) 从线密度曲线中计算出片段和放射标记的分子质量标准的相对迁移值。
( 6 ) 将代表标记物相对距离和长度的可变参数 a 和 b 代入方程：相对距离 = a X In (碱基对长度）+ b 。
( 7 ) 用上述公式将片段的相对距离值换算为核苷酸长度。
( 8 ) 通过结合整数的核苷酸长度值和将相应的强度信号平均化，将强度信号/连续长度分布转换为强度信号/整数（只列出分散的寡核苷酸长度）。
( 9 ) 通过将每个单独的强度除以强度总和，将分布均一化。
上述变性胶的放射能成像图见图 10.5B。强度均一化后表示为 “％mass”（ 见图 10.50。将这一实验与程序计算结果相比较确定的尿苷酸对胸苷酸的相对掺入值。程序计算中，设置的掺入值为 0.2~0.3，按 0.01 增长。当设置值为 0.26 时，实验和计算结果最为吻合，其中根据测量和均方根分析预测的片段大小范围为 10~150 个碱基， 而计算得到的可靠片段长度为 4~200 个碱基（图 10.50。当使用分子质量标准的范围时（20~100 个碱基），因子最佳的设置值为 0.25。很显然这些图谱重叠得很好，并且电泳条带中的峰和点都可以很好地解释（图 10.5B、图 10.50。重要的是，y 轴的值落在了不需进一步调整的位置。我们确信尿苷酸的掺入率是确定的，并且没有不完全断裂造成的影响，因为实验和计算得到的结果几乎一模一样，并且尝试了许多实验条件检测断裂情况。使 用 33.3% U 断裂的放射活性测量值与计算值也吻合得很好 。但使用 25% U 断裂的放射活性检测结果中产生了相当量的大于 100 bp 标准的片段，并且出现了一些因标尺问题引起的偏离。然而同样使用掺入率 0.26，与使用 EB 染色后的断裂结果相比较，考虑到凝胶染色的长度依赖性，结果十分吻合（图 10.5D ) ，其中 EB 染色因有合适的分子质量标准，对于较长片段更为准确。因为针对放射活性检测和 EB 染色的尿苷酸掺入 PCR 分别使用了不同的缓冲液（见 10.2.2)，多种 PCR 增强剂，如硫酸铵、吐温- 20 或 Triton X-100 的加入 对 dUTP 对 dTTP 的掺入率并没有显著的影响。
