影响RT-PCR的因素和反转录引物的选择
科研党们整天都在为提取RNA而烦恼，费尽九牛二虎之力，终于！RNA质量完美！可是。。。qPCR/PCR结果依然不好，咋整?！
在做qPCR/PCR实验之前，必不可少的一步就是反转录。别小看它哦，它在整个实验流程中发挥着重要作用！
反转录（Reverse transcription ）是以RNA为模板合成DNA的过程，即RNA指导下的DNA合成。反转录PCR（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction）是将RNA的反转录反应和PCR反应联合应用的一种技术（图1）。
图1
影响RT-PCR的因素主要可以概括为以下几点：
1） RNA的质量
反转录必须保证实验使用的RNA质量（如图2所示）：琼脂糖电泳胶图包括28S和18S两条清晰明亮的条带（真核样品），且28S/18S≈2:1，A260/280≈2.0，泳道无弥散区、无基因组、蛋白污染等。
图2 思科捷货号：AC0307，样本：玉米种子
2） 反转录酶的热稳定性
常规反转录酶发挥作用的最佳温度在42℃左右，但常规温度很难打开复杂模板中的二级结构，直接阻碍cDNA的继续合成；选择热稳定性高的反转录酶，可以在高温打开复杂模板中二级结构的同时发挥作用，极大的提高了复杂模板的反转录效率（图3）。
图3
3） 反转录引物的选择
反转录实验可供选择的引物主要包括3种，其各自特征及优缺点如下表所示。可见，根据后续实验的不同要求，需要选择合适恰当的引物进行反转录实验，这同样也是反转录PCR中重要的一环。
表1
引物类型 | 特征 | 优势 | 劣势 |
Oligo dT或 锚定Oligo dT | Oligo dT引物适用于识别mRNA末端的Poly A尾； 锚定Oligo dT在3’端包括G、C或A残基。 | 可从含Poly A尾的mRNA合成全长cDNA; 锚定碱基保证了引物结合在Poly A 5’端。 | 只能扩增含有Poly A尾的mRNA，对RNA样品的质量要求较高。 |
随机引物 | 含6-9个碱基，可随机识别并在退火时结合在模板RNA上。 | 可同所有类型的RNA结合；适合于含有二级结构RNA，或微量样本；得率高。 | 产物来自所有RNA模板，可能会对目的片段造成稀释；cDNA小片段较多。 |
序列特异性 引物 | 识别特定模板序列 | 产物特异性及反应灵敏度高。 | 只能合成特异性的某条序列。 |
图4
当所有试剂准备就绪，即可进行反转录体系的配制。常规的RT-PCR体系的配制需要加入引物、模板、反转录酶、RNase Inhibitor、RT Buffer、dNTP、RNase-free H2O等等试剂，操作步骤繁琐复杂。
那么，重点来啦！！
AG0304试剂盒为一管式反转录预混 Mix，其中2×SPARKscript Ⅱ RT Plus Master Mix 中含有反转录第一链合成所需的所有试剂（SPARKscript Ⅱ Hˉ RTase、RNase Inhibitor、Random Primer、Oligo（dT）Primer、dNTP Mixture、Buffer），其中特别优化了Oligo dT和N6随机引物的配比，使cDNA合成可从RNA转录的各个区域起始并具有相同的反转录效率，最大程度保证后续实验结果的真实性和可重复性；此外，试剂盒中还包含具有 DNA 分解活性的特殊 gDNA Eraser Mix，5 分钟消除 gDNA 残留，不需要 DNase 消化或更多繁琐步骤。
