RT-PCR技术的影响因素
(一)组织或细胞样本
不是每种组织或细胞都表达所有的基因,即某些基因的mRNA不存在于某些组织或细胞中。因此,确定所选用的材料中是否含有需扩增的目标mRNA模板是实验成败的关键。
(二)引物
合成cDNA第一条链时,引物可用随机6聚核苷酸,或下游引物,或poly(dT),其中以6聚核苷酸的随机引物效果最好。
(三)反转录酶
不同来源的反转录酶均可较好地用于第一链cDNA的合成,其合成受不同RNA模板的影响。提高反转录温度(55℃)、增加1~3倍的酶量可克服RNA二级结构的影响。
(四)cDNA反应产物
合成eDNA第一链所用的RNA模板不影响PCR反应,无需用碱或RNase处理去除。另外,没有必要将cDNA反应产物全部用于PCR,用其1/25~1/10即可。
(五)RNA酶污染
避免RNA酶污染是RT—PCR成功的关键之一。用于RNA操作的各种器皿,包括Eppen—dorf管、Tip头等,都应该用RNA酶抑制剂处理,试剂应该用RNase—free水配制。使用的全部器皿和耐高压的试剂都必须经高压灭菌处理。在操作全过程中,操作者都应该戴一次性手套和口罩,以防污染。
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