方法开发从何开始？（二）
表1和表2中的变量归类方式有点不一样。这里列出了一些变量的特性，可以帮我们来确定首先选择哪一个（类）的变量。我们详细地探讨一下溶剂强度，然后会简要提到表2中其它变量。因为如果能理解表2 中所列的内容的话，大多数的信息就很容易理解了。
溶剂强度（%B）：在方法建立过程中，色谱峰间距α的变化是一个希望通过改变参数得到的结果，所以该参数列在我们首选参数的首位。％Ｂ的变化在很多时候导致α的变化，但是它不是最有能力引起色谱峰间距改变的变量。所以给了０或中性的评价。溶剂强度的变化作用与每一个化合物类型并且容易实施只要在液相系统控制器中设置一不同流动相的混合程序所以，这些特性参数可得一个＋。乙腈在低紫外波长范围（<220nm）区域具有很好表现，甲醇在等度洗脱时在低波长范围也很好，但是不适合用于梯度洗脱，在<240nm以下，四氢呋喃具有很强的吸收，应用不是太广。尽管当有PEEK管使用时，不能用四氢呋喃，但以上三种溶剂均可用于液相－质谱联用（LCMS）体系，总而言之，检测不是问题，所以此处也是＋。溶剂强度容易控制，并且能产生耐受性很好的分离效果，同时不论是等度还是梯度洗脱，色谱柱平衡很快，所以，在这方面也是＋。可以看到溶剂强度虽然不是改变α的最有力的变量，但它是在所有其它方面有积极的影响。所以它是在方法建立过程中我探究的首选变量。
温度：按照改变峰间距α的想法，温度常常被认为是一个影响力较弱的变量，同时很多色谱工作者常常忽视它。可是，在其它的分类中，它的分数很高。所以依据其它的数据，温度值得十分认真的考虑一下。例如，在某些情况下，对于离子性样品，温度改变的效果如同pH值改变一样，但是更容易控制。实验也证明，选择性的改变温度和梯度洗脱是一个非常强有力的组合。
表2.色谱变量
溶剂类型：流动相有机溶剂由甲醇到乙腈到四氢呋喃的变化是一个改变选择性的有力的方式，适用于所有的化合物类型，并且很容易实施。在240nm以下，四氢呋喃有强烈的紫外吸收，不可以用在使用PEEK管LC-MS中。由于基线的漂移，在220nm以下梯度洗脱时很难使用甲醇。但在A-溶剂中添加紫外吸收的物质，则在低波长范围可用于梯度洗脱。乙腈和甲醇的色谱柱平衡不是问题，但用四氢呋喃时平衡时间会稍稍加长，混合不同类型的溶剂，特别是少量的四氢呋喃和乙腈或者甲醇混合，会产生中间溶剂的特性，可以用来改变色谱峰间距。利用系统控制器，在无人看管的状态下在线混合溶剂。
离子对：离子对色谱对提高保留性质非常有用，特别是对于亲水性的，碱性化合物，并且可以有效地改变峰间距。可是，离子对试剂对于非离子化合物没有作用，同时也会带来许多试验上的问题，如非常慢的柱平衡，所以大多数色谱工作者认为在考虑离子对变量之前，先考虑其它因素。
pH值：改变色谱峰间距最有力的变量是溶液的pH值，但只是对离子化合物有效。改变pH值不难，但必须准备一个新的缓冲溶液，因为在线改变pH值是不可靠的。缓冲溶液需在低紫外波长段或LC-MS检测下工作良好，但是许多缓冲液不能在上述的一个或两个技术中使用。如果pH接近于被分析物的pKa，分离非常容易受pH细微变化的影响，例如使用在缓冲范围以外的缓冲液，或改变温度或有机溶剂的浓度。可是，如果控制了流动相的pH值，大部分分离会更顺畅，因为pH会影响色谱柱和样品分子的离子化作用。所以，最好控制住流动相的pH值，即使pH值不是被当作首选变量探究的。大多数情况下，2 < pH < 3是流动相pH值的一个推荐值，除非不得不使用其它的。
色谱柱类型：正如前面提到的，改变色谱柱类型是个改变选择性的非常有效的办法，尤其是用特定柱选择性比较工具帮助选择备用的色谱柱时。在用正交试验选择色谱柱子时缺少这样的指导，成功地选择一个不同选择性柱子的能力很有限。例如，在两个不同的C18柱子之间可能比一个C18柱子和一个键合柱子之间有更大的不同。因为色谱柱是一个不持续性变量，改变更不方便，色谱柱必须被拿掉，更换或者采用柱切换技术。而且，换色谱柱的花费远远大于改变任意其它变量的。所以，大多数色谱工作者更喜欢开始用一个提供足够理论塔板数的能分离大多数样本的柱子，然后在换用另一个不同柱子之前改变其他变量。
结论
如果我们考虑之前讨论的各种参数的优缺点，就能选出明智的起始点。根据特定的样本信息，这些条件可被以改变，但是没有其他的数据。这些为方法开发这场“比赛”提供了一个很好的安置“起跑器”。
我推荐从一个能在“典型”样品产生足够理论板数的C18或C8的色谱柱开始方法开发，通常是选一个规格为150mm×4.6mm，5μm粒径，或100 mm×4.6mm，3μm的色谱柱，流速1~2ml/min。对于LC-MS和分离能力不必太强的应用，50 mm×2.1mm，3μm的色谱柱，流速0.2~0.5ml/min通常是首选。一个略高于室温的温度，如30或35摄氏度，是很好的起始温度。当然，你应该选一个更新的B型柱或是高纯度硅胶柱，并且在开始一个新方法开发时用一个新柱子。
硅胶键合相色谱柱在2<pH<8的范围内最稳定。pH值为2.5~3.0和15~25mM的磷酸盐缓冲液适合于紫外检测。对于LC-MS和其它的检测器需要挥发性的缓冲液，0.1%的甲酸是不错的首选。低pH值会抑制柱子中硅烷醇基团和大多数酸性样本化合物的电离。在高于大多数碱的pKa工作时，需要能在pH＞8稳定的色谱柱。在这样高的pH值下工作通常不是第一选择。
乙腈是有机溶剂的最佳选择。低至200nm它都有良好的紫外透过率，并且很适于LC-MS。甲醇也是不错的选择，但是在波长低于220nm时它有很强的紫外吸收。因为低波长下的糟糕表现，与PEEK不相兼容和不便的操作特点，四氢呋喃不常被使用。
这些柱子和流动相条件是大多数分离的起始点,对于一个特殊样本类型分离的认识可能会建议其它起始条件。在起始条件确定之后，就可以探究表1和表2中的变量来得到一个想要的分离。
