方法开发从何开始？（一）
如何更有效地进行液相方法开发，除了准确地设立一个新方法的目标外，选择方法开发的起点也是一个重要因素。从“液相故障排除”的宗旨来讲，在方法开发过程中的许多选择会决定一些问题会在最终方法中碰到或者避免。所以，每一个特性参数需要根据方法开发中可能出现的问题及完整的方法进行优化。
在方法开发中的第一个选择是要确定所用的液相色谱类型，通常有反相色谱，正相色谱，亲水相互作用色谱, 离子交换色谱，分子排阻色谱，手性及其它类型的色谱可以选择。对于从事制药业，环境及化学工业的人来说，反相液相色谱是最好的选择。
每年春天的Pittcon会议上，在色谱柱领域，不论是总体使用还是新品介绍，最普通的柱子都是反相柱子。原因很简单，它们满足了大多数分离问题的需求，容易使用且合理耐用。如果我是一个赌徒的话，我会每次都把钱押在反相色谱上，除非我有更好的理由进行其它的选择。
当然，也有一些显著的应用需要其它的色谱类型，如果样品含有手性化合物，需要采用手性色谱柱，手性流动相或者手性衍生化进行分离时，反相色谱就无法发挥作用。若需要保存酶或其它生物分子的活性，应避免采用反相液相色谱，因为其流动相具有很强的变性能力。分离离子型化合物时，尤其是无机离子，最佳的是采用离子交换或离子色谱。位置异构的化合物在反相液相色谱中很难分离，通常采用正相液相色谱。所以如果样品具有不适用采用反相液相色谱技术的特性的话，通常来说，是采用更容易取得成功的色谱类型。但是，对于绝大多数化合物来说，反相色谱是最好的起始点。
连续或者不连续？
既然已经决定反相色谱柱作为初始的色谱柱类型，我们需考虑一下如何获得一个反相色谱的分析方法。对于在方法开发过程中我们可用的变量，我们需要明智的选择来充分利用时间和钱，方式之一是把参数分类无论它们是否是连续的变量，正如表1所示。连续变量是能以无限小的幅度变化，在调整分离中很有优势并且方便使用。因为连续变量的浓度或数值是变化的，所以保留按一个有规律的趋势变化，通常是线性或对数的方式。不连续变量只能分段式地变化，所以保留不会以连续的方式变化（见表1）。
溶剂强度：溶剂强度是指在流动相中强溶剂的量。在反相液相色谱中通常是甲醇，乙腈或四氢呋喃。 常常以B-溶剂的百分比表示（%B），当然，我们可以任意来改变%B的量。
温度：温度可以很容易地从高于室温几度到柱温或柱温箱的最高限度，大多数系统为30~70℃ 。
溶剂类型：溶剂的类型可以从甲醇到乙腈到四氢呋喃进行变化。乍看起来，你可能认为这是不连续的变化， 但经过进一步检查，它是连续的。例如，按照任意比例将甲醇和乙腈混合，就会做出一个连续的变量。事实上，混合溶剂可以显示超强的能力，每一个溶剂的特性能被充分调整具有最大的分离能力。
添加剂：流动相中添加剂的浓度，如缓冲液，离子对试剂，盐或胺可以在流动相中从0到饱和点连续地调节。
pH值：流动相的pH值介于连续和不连续的变量之间。所以将它列在表1的括号里。大多数的反相色谱柱都可以在2 < pH < 8的范围内使用，对碱稳定的色谱柱还可以在更高的pH值下使用。pH值可以以连续的方式调节， 故pH是连续的变量。可是，pH值改变的效果是不连续的，在化合物的pKa ±2的pH值范围，pH值对保留的影响是可以预见和有规律的，但超出该范围，pH值的另外改变常常对保留没有多大效果。
色谱柱类型：色谱柱类型的改变，像C18从键合极性固定相到氰基到苯基是以间断幅度进行的，例如，你无法以1%的幅度由苯基取代氰基，色谱柱变化不连续的特性意味着你无法调整这变量。色谱柱可以是这种或那种类型，但不可能是几种色谱柱类型的组合。有一家公司（Bischoff，Leonberg, 德国 ）制造一种色谱柱，它是将包含不同类型固定相色谱柱片段连接在一起，即使如此，色谱柱的变化仍是有限的阶梯式的变化。
哪一个变量优先考虑？
在改变色谱柱类型之前，调整变量影响的能力和色谱保留性模拟软件（如DryLab，Molnar Institute ，Berlin）的商业实用性给了我们关注表1中持续型变量的动力。接下来我们需决定首先关注哪一个参数。依据很多的选择，我们希望第一个选择的变量是具有合理的可成功分离可能性的参数。可是同时我们想要的是变量在分离中引起改变的能力和在变量中做调整的不费力达到平衡。
表1.变量的分类
