用于免疫印迹的动物培养细胞、酵母和细菌的裂
基本方案
| 实验方法原理 |
去垢剂裂解细胞法通常用于培养的动物细胞。典型的离子型去垢剂SDS(如2%SDS)能充分地裂解细胞。培养的动物细胞和细菌，如可以使用这种方式裂解。假如实验所用的抗体识别的抗原决定簇取决于自然空间构象，并对还原环境敏感，那么在裂解缓冲液中应除去二硫苏糖醇，并建议使用非还原/无脲的凝胶 |
|---|---|
| 实验材料 | 悬浮或单层的细胞培养物、细菌或酵母细胞 |
| 试剂、试剂盒 | 二硫苏糖醇（DTT) 1×Laemmli样品缓冲液 |
| 仪器、耗材 | 离心机 水浴锅 |
| 实验步骤 |
① 将1X107〜5X107个细胞加到1ml含有100mmol/L DDT的Laemmli样品缓冲液中。 ②由于DNA的释放，在Laemmli缓冲液中细胞裂解液变得很黏，克服黏性问题有2种方法： a．离心裂解液100000g，20min，除去DNA; b.超声破碎裂解细胞，每次超声15〜30s，共4次，每次之间将样品在冰上放置15s。 ③在95℃水浴加热样品5min。 ④20000g离心5min. ⑤转移上清到一个新管中。 ⑥样品（上清）现在可以用于电泳和免疫印迹。在免疫印迹研究中，制备培养细胞提取物时，蛋白样品必须满足以下条件： a.溶于适合凝胶电泳系统的溶液中（如，溶液的pH值应该在7.0左右，并且盐浓度为200 mmol/L左右）； b.蛋白浓度不能超过特定凝胶系统的承载能力。对于传统凝胶，小胶的每个泳道的上样量不能>150μg的总蛋白
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| 注意事项 |
1×Laemmli样品缓冲液： 2%SDS 10%甘油 60mmol/L Tris-Cl(pH3.8) 0.01%溴酚蓝 通常把Laemmli样品缓冲液制成2X或5X的储液比较方便。在使用前，加DTT至终浓度100mmol/L。
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