盘点CAR-T实验十大雷区（一）
话说肿瘤医院的熊主任自从看到陈博上期的《CAR-T实体瘤靶点英雄谱：夜空中最闪亮的星》 之后，鸡血满满，奋发图强要做CAR-T实体瘤研究！派出得力干将汪博士！选择靶标！设计载体！体外验证！体内实验！过伦理！上临床！出任院长！迎娶白富美！走上人生巅峰！
然而，半年过去了，熊主任内牛满面抱着陈博大腿哭诉：“一入CAR-T深似海，从此节操是路人”“为啥我的实验不顺利？”“为啥CAR-T研究到处都是坑？”
陈博也很无奈：“老熊啊，你就是太顽皮，讲座听得不认真，其实很多技术难点我已经跟你讲过的，今天我再给你盘点一下吧”
【第一坑】你的scFv序列靠谱么？
子曰：靶标易得，抗体难筛！对于常见的靶标，scFv序列的种类浩如烟海，熊主任一脸懵逼，不知所措。
如何在几种肿瘤靶标中取舍？
如何从鱼龙混杂的scFv文献数据和ZL数据中沙里淘金？
如何绕开坑爹的假数据？
如何找到亲和力最高的那一类scFv？
如果想自己筛新抗体，怎么做？
老熊，吉凯有秘籍，嘿嘿嘿……
（常见靶点数据请参考本公众号4月21日的文章：《CAR-T实体瘤靶点英雄谱：夜空中最闪亮的星》，可在“查看历史消息”中找到）
【第二坑】你的CAR病毒的质量过关吗？
熊主任能力逆天，向来自己包病毒，但病毒质量和稳定性遇到了坑。
且不说支原体、细菌、真菌、病毒毒性这类基本检测必须全为阴性，内毒素<50 EU/ml也必须达标！
老熊啊，你以为这样就是合格的CAR病毒么？图样图森破！染了病毒的T细胞为啥状态不稳定？CAR-T的动物实验为啥重复不出来？请问你的CAR病毒经过渗滤纯化了吗？总DNA残留不能超过10 ng/ul，BSA残留不能超过30 ng/ml！怎么样？怕了吧？！
另外，现在连吉凯的屌丝版慢病毒都已经在用QPCR绝对定量测滴度了，老熊还在用不准确的活性滴度来染T细胞么？别再拿载体空壳来糊弄T细胞了好不好？！
说到这里，陈博已经不好意思再拿吉凯的GMP级病毒载体生产车间的照片来炫耀了，那风景大家自己想想吧~
（详细数据请参考本公众号4月8日的文章：《高大上的CarT慢病毒是怎样炼成的》，可在“查看历史消息”中找到）
【第三坑】你以为自己真的会分离PBMC吗？
临床前实验的T细胞哪里搞？熊主任回头看了看面无血色的汪博：“小汪，来来来，再抽点儿血撒~”
老熊啊！你的博士要省着点儿用啊，咱先把PBMC的实验条件摸熟了再上吧，否则明年招不到人啦！
Ficoll离心要慢升慢降知道吧？
Ficoll对T细胞是有一定毒性的，总量要控制哦~
Ficoll吸多了还会导致PBMC洗涤困难呦~
PMBC的抽提基本要求：纯度>90％，收获率>80％，活细胞率>95％，请善待每一个博士生！珍惜他们的血和泪！
【第四坑】同学，你的T细胞贴壁了吧？
在熊主任的严格管理下，汪博士常年处于亚健康状态，抽出来的T细胞也是萎靡不振，勉强养了三天，全贴壁了……常年研究实体瘤的熊主任和汪博士大眼瞪小眼，悬浮细胞咋就这么难养捏？
老熊啊，你以为往培养基里简单加点儿IL-2就万事大吉了么？其他的细胞因子表示不服！
哪种血清效果好知道不？
T细胞的培养密度摸清楚了吗？
喂！实验操作不能再像实体瘤那么粗放了！
【第五坑】你的T细胞感染效率为啥无法突破50%？
老熊派汪博去血液科实验室刻苦学习了一个月T细胞养殖大法，汪博学成归来，果然T细胞养起来了，好开森！好哈皮！CAR病毒染起来！
咦？感染效率肿么只有10%！难道是打开的方式不对吗？
“汪博，再给朕染一次！”
“启禀圣上，这次只有8%了……”
“小汪啊，不是我给你压力，感染效率提不起来，你每个月要多抽几次血哦，为师很担心你的健康呦~”
“熊老师…我还是处男呢，我不想死啊~~~”
“憋墨迹，快去找陈博想想办法！”
另一边，陈博一边给汪博递纸巾一边安慰：“老汪啊，你该早点儿来找我，吉凯花了两年时间开发了一套CAR-T感染试剂盒，绝密配方，T细胞感染效率可达40-80%！别哭了，快喝了这碗红糖水”
