多重数字PCR技术介绍
什么是数字PCR？
数字PCR是一种新的绝对定量PCR，通过对PCR反应物进行有限稀释，随后在不同的反应腔室里进行PCR扩增，最后根据泊松分布原理及阳性微滴的个数与比例得出靶分子的起始拷贝数或浓度的技术。
什么是多重PCR？
多重PCR又称多重引物PCR或复合PCR，它是在同一PCR反应体系里加上两对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应；由Chambehian'于1988年首次提出,其反应原理，反应试剂和操作过程与一般PCR相同。理论上只要PCR扩增的条件合适,引物对的数量可以不限,但由于各种条件的限制,实际能够扩增的引物对数量是有限的。
什么是多重数字PCR？
多重数字PCR是在同一数字PCR反应体系里加上两对或两对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的数字PCR反应。将多重PCR技术与数字PCR技术有机结合而形成的多重数字PCR，根据DNA探针不同荧光度、DNA扩增不同循环数及多种标记荧光同时使用，便可大幅提高数字PCR多重性，多重性可达20-50以上，即同时在一个PCR反应单元内进行20-50个以上的数字PCR反应。
多重数字PCR在医学检测中的优势
在数字PCR中实现多指标的并行检测能显著降低检测成本，获取更丰富的检测信息。在一个PCR反应中完成基因多个突变位点的检测，即一个PCR反应即可完成一个Panel的检测，在医学领域有着不可替代的优势。
其优势可以简单概括为以下三点：
1高效性。
在同一PCR反应管内同时检出多种核酸片段，或对有多个型别的目的基因进行分型，特别是用一滴血就可检测多种病原体。
2系统性。
多重数字PCR很适宜于成组核酸片段的检测，如肝炎病毒，肠道致病性细菌，性病，无芽胞厌氧菌。
3经济简便性。
多种核酸片段在同一反应管内同时检出，节省时间、试剂耗材和经费，为临床提供更多更准确的检测信息。
多重数字PCR的检测类型
数字PCR的多重检测主要通过以下两种方式实现：
1、多个荧光通道。使用多种荧光染料来标记不同的要检测的靶基因。
2、单波长多强度。使用一种荧光染料，但是扩增结束时不同的靶基因对应的染料的荧光强度不一样。
多重数字PCR在临床领域的应用举例：
1.多重数字pcr技术检测肺癌EGFR基因突变
来源：Mol Med Rep.2017 Aug;16(2):1157–1166
EGFR基因突变位点的检测是指导非小细胞肺癌患者临床用药的依据。其中最常见的是21号外显子L858R突变，19号外显子缺失以及20号外显子T790M突变。但是临床样本往往是有限的，尤其是液态活检样本，因此多重检测可以节省大量检测样本及检测成本。
2，多重数字pcr技术在染色体非整倍体筛查中的应用
来源：Analyst.2019 Mar 25;144(7):2239-2247
High-Precision Chromosomal Copy Number Measurement using RainDrop®Digital PCR Application Notes
数字PCR技术具有单分子灵敏度和绝对定量的能力，能够区分微小差异，很适合用来进行无创产前检测。由于胎儿游离DNA占孕妇外周血中游离DNA很小一部分，常规实验一对引物探针要想准确分辨胎儿染色体倍数需要提高足够多的模板（约41-252ng，胎儿DNA比例10%-4%），这么大量的DNA临床一般无法提供(1ml血常规只能获得1-7ng cfDNA)，这时通过多重数字PCR设计40对引物和2个通用探针扩增21号和18号染色体上的各20个片段，就能很好的解决这个问题。结果显示以10ng cfDNA作为起始模板，使用多重数字PCR技术能够精准分辨21-三体综合征。
3.探针成本太高，没关系我们用染料法也可以做多重数字PCR
来源：Anal Chem.2013 Dec 3;85(23):11619-27
通过改变扩增产物的长度，或者调整引物的量，或者改变反应的Tm值等条件，可以轻松尝试多重数字PCR反应。
4.染料法也可以检测点突变
来源：Anal Chem.2014 Mar 4;86(5):2618-24
染料法也可以检测SNP点突变，通过在上游引物末端添加一段序列，改变突变型或野生型扩增产物长度即可轻松实现多重检测。
