蛋白质凝胶染色法实验（二）
关键步骤通常如下所述。
(1) 固定凝胶，以固定蛋白质条带，并移除凝胶中的干扰物质, 如 S D S 、缓冲液和盐，这些物质会结合银并造成背景染色。
(2) 用能够结合蛋白质并提高银结合能力的物质, 或是能够干扰剩余未结合的银造成的背景染色的物质来孵育凝胶。总之，这些各种各样的方法都和敏化作用有关。
(3) 银离子浸泡处理凝胶。
(4) 结合的银离子还原成不溶且可见的金属银，便出现了有色度的银染信号。
(5) 终止显色过程，以防止凝胶介质中的背景染色遮掩住蛋白质条带。后两个步骤对时间的依赖导致了技术的复杂性, 步骤 (2)〜(4) 中几次需要一定时间的清洗步骤也是如此。
银染法在银试剂和相应显影条件的基础上明显存在区别。碱性法将碱性环境下一种银的二元胺复合物作为银试剂, 并在酸性甲醛溶液中显影; 酸性法将弱酸性硝酸银作为银试 剂 ，并在碱性甲酸溶液中显影。酸性染色法最近变得更受欢迎，因为它相对于碱性法降低了成本，并且背景染色也更容易控制。
目前有很多增敏剂。芳香族横酸盐 (如二磺酸萘或磺基水杨酸) 能结合蛋白质，也能结合银; 剩余的与蛋白质结合的 S D S 也可以加强银的结合力。同样的，已被考马斯亮蓝染色的凝胶，如果再进行银染，同样可以提髙银染的强度。戊二醛作为增敏剂得以广泛使用, 其原理在于引入了还原性醛基，能同蛋白质中的自由氨基相结合。硫化试剂，如连四硫酸盐或硫代硫酸盐能在蛋白质附近引入自由 S2- ，该离子会立即与银离子反应并形成不溶的硫化银。
因为在固定和增敏过程中使用戊二醒会造成蛋白质修饰，故银染后进行的蛋白质质谱分析会有问题。那些能同质谱分析相兼容的方法都不使用戊二醛，而这可能会使敏感性相对降低。增敏步骤若依靠连四硫酸盐和硫代硫酸盐，显影步骤将会相应地延长。因此 ，若银染后需要质谱分析，可以先对胶体进行考马斯亮蓝染色，再进行无戊二醛的银染步 骤 ，这是一种便捷的两步估算出蛋白质样品纯度的色度方法。
Zn 2+ 反染法
在 S D S -P A G E 后 ，不依靠固定剂或有机染料，使用金属阳离子快速对蛋白质染色的方法有很多。 Z n 2+反染法利用的是蛋白质和蛋白质-S D S 复合物结合及隔离环境中的Z n 2+ , 而在此环境中咪唑和 Z n2+之间因沉淀反应会产生咪唑锌 (Z n I m 2), 并产生不透明的背景，同透明的蛋白质-S D S Z n 2+ 区域形成对比。该技术是一种非固定步骤, 在随后预期的微量分析，如洗脱条带的生物分析或酶分析中很有帮助，并且能同质谱分析或微量测序方法相兼容。该染色法迅速快捷，但检测灵敏度低于考马斯亮蓝染色法。
用 于 I m m 厚度的凝胶的 Z n 2+ 快速反染法步骤如下所述。
(1) 电泳之后，将凝胶浸泡在〇.2 m o l /L 咪唑、0.1% S D S 中 15 m i n 。
(2) 弃去咪唑溶液，再将凝胶浸泡人〇.3 m o l /L 硫酸锌孵育 30〜45 s 显影。
(3 ) 弃 去 上 述 显 影 液 ，用 水 清 洗 凝 胶 若 干 次 ，每 次 I m i n 。
(4)
将 凝 胶 保 存 在 0 . 5 % ( m /V ) 碳 酸 钠 中 。显 影 过 度 会 有 问 题 ，但 是 可 以 通 过 将 凝 胶
泡 在 1 〇 0 m m 〇 l/L 甘 氨 酸 以 溶 解 过 量 的Z n I m 2 来 解 决 。尽 管 不 透 明 背 景 下 的
透 明 蛋 白 质 条 带 没 有 像 考 马 斯 亮 蓝 染 色 法 或 银 染 法那 样 有 明 显 的 颜 色 对 比 ，但 是 可 以
在 黑 色 背 景 下 照 明 凝 胶 成 像（Fernandez-Patron，2005;
Fernandez-Patron et al. ，1998)
2. 总蛋白质荧光法染色
荧光染色法结合了检测灵敏度 (可与银染法媲美) 与染色流程简便性 (与考马斯亮蓝染 色 或 Z n 2+ 反染法相同），且其线性定量范围较比色法大 10〜100 倍 。检测依赖于仪器,需要一个单色激发光源、能将波长较长的发射光从波长较短 (也更亮）的激发光中分离出来的选择性光学滤镜以及一个检测模块。对于许多荧光染料，可通过目视检测，但是其灵
敏度不及采用摄像或仪器的方法。任何荧光染料都会带来一定程度的光漂白,
这是曝光的结果。许多市面上可购买的荧光染料已得到改进，光稳定性相对较好。尽管如此，在目测和图像采集前,
仍要小心避免将凝胶过久暴露于的外界强光之下。本章讨论的荧光染色法和染料的激发与发射的极限值在表 31.1 中呈列。通 常
，光激发和发射的颜色经常以大类区分，即紫外线（U V )250 〜400n m ; 蓝 光 400〜500 n m ; 绿 光 500〜550 n
m ; 黄光/橙 光 550〜580 n m ; 红 光 580〜650 m n ; 近红 外 线 650〜850 n m
。这也是下面讨论的目的。
荧光染料通常可分为两类: 在蛋白质条带部位表现出显著加强荧光效果的荧光染料和特异地结合蛋白质条带而不与凝胶基质结合的自发荧光染料。最早商品化的总蛋白质荧光染料，S Y P R O O r a n g e 和 S Y P R O R e d 凝 胶 染 料 于 1 9 世 纪 9 0 年代出现。这些染料最初是用于凝胶中染色 D N A 的常规荧光检测, 其检测方法是，先 经 300 n m 紫外线透射，随后进行宝利来一步摄影 (Polaroid photography)。开发上述商品化突光染料的目的是建立类似于溴化乙淀或 S Y B R Gre e n D N A 染色法一种简单的、一步式的总蛋白质特异染色和记录的工作流程，并且具有超越考马斯亮蓝染色方法的检测灵敏度。总蛋白质染料进一步的发展，产生了一些检测灵敏度范围近似于甚至超越了银染法的商业产品或配方。那些不需要在电泳前为样品加上共价标签的荧光凝胶染色法，与之后洗脱蛋白质条带的质谱分析相兼容。
