蛋白质凝胶染色法实验（四）
(3) 用 10% 〇 //V ) 甲醇、7 % ( V /V ) 乙酸进行简单的凝胶脱色。
利用基于微波炉的方案可以加快染色过程的进行。
SYPRO R uby 蛋白质凝胶染料具有相对较高的消光系数和量子产率，因此它十分亮眼,
化学稳定性和光稳定性都很高。光谱的激发可借助紫外线或是蓝光光源;
蛋白质带目测呈橘红色。荧光蛋白质染色的机制在于该染料与蛋白质条带和凝胶介质结合的差异性,
凝胶介质不与染料结合。因此蛋白染色剂本身是不具荧光性的。 SYPRO R uby
蛋白质凝胶染料亮度大、稳定性高、检测灵敏度强且便于使用，加上其蛋白质组应用的文献之多以及积极的市场营销攻势，该产品
为其后蛋白质凝胶染色剂的发展提供了比较标准，正如银染法仍然是检测灵敏度的比较基准一样。
Epicocconone 蛋 白 质 凝 胶 染 色 剂 ： Deep Purple 和 Lighting Fast 蛋白质凝胶染色剂
Epicocconone 蛋 白 质 凝 胶 染 色 剂 是 种 从 真 菌 黑 附 球 菌 (EpicoccMOT Tiignwn) 中提取的荧光团，用于总蛋白质染色试剂盒中。该染料被冠以了多种商品名称，包 括 DeepPurple 和 Lighting Fast 总蛋白质凝胶染料，方案各异。下面是一种方案。
(1) 将 SDS-PAGE凝 胶 在 7.5%(V/V) 的 乙 酸 中 固 定 1h。
(2) 用水清洗凝胶 (2X 30 m i n )。
(3) 荧光团储备液在水溶液中稀释后, 将凝胶在该水溶液中染色 I h。
⑷ 将 凝 胶 在 0. 05% (V /V ) 的氨水中孵育 (3X 10 m i n );
(5) 立即捕捉影像，可用紫外线、可见蓝光或可见绿光激发。
该染色剂的灵敏度可与 S Y P R O R u b y 蛋白质凝胶染料相媲美，或 者 较 之 更 好（Belland K a r u s o ，2003; Mackintosh etal. ，20 〇 3)。染色是可逆的，并与质谱分析兼容。暗红色的信号并非特别显著，其灵敏度完全取决于染色剂的荧光特性, 因此背景较弱。该染色方法似乎需要痕量的在乙酸固定后仍然与蛋白质形成复合物的 S D S 。 这种染色剂在水中仅发出微弱的荧光 (绿色），但 是 在 经 S D S 处理的蛋白质存在的情况下，荧光增强并发生红移 。 Epicocconone 蛋白质凝胶染料已被证实能与赖氨酸反应，形成可被碱水解的荧光加合 物 ，因此产生突光并使得染色具有可逆性 (Coghlan et al. ,2005)。浓缩的染色储备液必须冷冻保存，在使用前解冻。考虑到稳定性因素，影像捕捉应该在染色结束后立即进行。
荧光素衍生物
含有烃类尾部的荧光素衍生物是很有效的蛋白质凝胶染色剂。将 5-十二酰基氨基-(C 12-F L )、5-十六酰基氨基-(C 16-F L ) 及 5-十八酰基氨基-奕光素-(C 18-F L ) 用于一些类同于经典考马斯亮蓝 R -250 染色法的样品染色方案中，可证明该染色剂敏感度比得上银染法。最 有 效 的 荧 光 团 为 C 16-F L 。例 如 ，凝 胶 染 色 时 染 液 为 3 0 % (V /V ) 乙醇、7. 5 %(v/v) 乙 酸 、1umol/L 染料, 染液更换两次。再用水清洗，水也要更换两次，最 后 用 7.5%乙酸脱色。染色剂具焚光性，易知其基本原理是同结合在复合蛋白质中的残余 S D S 相结合; 可兼容质谱分析 ( K a n g et a L ，2003)。荧光素的光谱激发和发射分别由蓝光和绿光完成。
K r y p t o n 蛋白质凝胶染色剂
K r y p t o n 蛋白质凝胶染色剂是受ZL保护的轻基喹啉 (hydroxyquinoline) 类染料配方 ，激发光谱为绿色，突光显色为橙色 (Wolf et al. ,2007) 。 K r y p t o n Infrared 蛋白质凝胶
染色剂含受ZL保护的香豆素/氟喹诺酮和/或玛蒂娜
(Martina) 型染 料 , 激发光谱为红光/近红外线，发射光谱为近红外线 ( C z e m e y et al.
,2008)。可以买到这些产品的 10X 的组分 并 需 要 先 稀 释 成 可 用 的 溶 液 。这 些 产 品 在 检 测 灵 敏 度 和 动
态 线 性 范 围 方 面 同S Y P R O R u b y 和 D e 印 P u r p l e
蛋白质凝胶染色剂相当。染色方案依照标准的固定-染色-快速脱色的工作流程，并在快速染色方面得到改进, 因此整个染色过程可在 1〜4 h
完成；若要追求最高灵敏度和信号线性度, 可以延长此方案的时间。这些染色剂均可以和质谱分析兼容使用。
F l a m i n g o 蛋白质凝胶染色剂
Flamingo 蛋 白 质 凝胶染色剂是受ZL保护的基于香豆素的花青染料配方（Berkelm a n ，2006)。该染色方案需要在染色前完成固定。可以买到的染料为 I O X 的储备液，使用前用水稀释即可。当染料与蛋白质结合时表现出荧光增强作用。该染色剂背景较弱，报道称短脱色步骤可使背景进一步减弱。激发光谱在绿光范围内, 信号为橙色/红色。该染色剂被认为与银染和 S Y P R O R u b y 相当，并且也可以兼容质谱分析。
L U C Y 蛋白质凝胶染色剂
LUCY蛋白质凝胶染色剂是受ZL保护的三甲川花青(trimethinecyanine) 染料配方 , 在 S D S /蛋白质混合物中表现出荧光增强作用。染色通常在稀释的乙酸中进行，方法与 S Y P R O O r a n g e —样 。据报道该染色剂也能与质谱分析兼容 (Kovalska et al.,2006)。
3.预 电泳样品标记
琥珀醜亚胺酯是一种用于电泳前蛋白质样品的共价氨基标记的电荷平衡的花青染料(Cydye)，它的研发和使用已成为荧光二维差异凝胶电泳（2- D D I G E ,—种非常重要的蛋白质组技术）的基础（M i n d e n et al. ,2002; T o n g e et al. ,2001; W a g g o n e r et aL ,1993)。D I G E 在 第 30 章中有更详细的讨论。有许多荧光复合物的琥珀酰亚胺酯以及其他能反应的荧光共价蛋白质标记物也同样被广泛使用（H a u g l and ，2005)s 如今拥有了广泛的仪器基础，对任何荧光标记的蛋白质制备物组分进行凝胶分析已是常规步骤。
