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终点PCR中的顶配—热启动PCR聚合酶组合的使用方法(一)

2021.3.02

     每次PCR实验都要到处找冰盒,铲冰…… 各种怕温度敏感的酶在小小的PCR小管里发生不该发生的story,比如非特异扩增,悄悄地合成引物二聚体等,最后P出来各种条带,我们就要cry了。

 

       那么,如果我们使用了热启动DNA聚合酶,故事就不一样了。经过化学修饰的TaqDNA聚合酶,对温度“炒鸡”稳定,PCR加样再也不需要到处找冰盒铲冰,小心翼翼的忐忑了。HoT FIREPol®热启动DNA酶常温稳定一个月,只有温度达到95℃才会被激活。所以我们再也不必担心加样的过程以及升温之前,PCR就开始反应,合成不需要的片段。做到随意PCR 如吃瓜!
 

       好啦,言归正传,吃瓜的同时,我们来点专业解释:

 

       在传统的PCR反应中,反应体系各成分(Taq DNA聚合酶、dNTP 和引物等)均是一次加入并进入循环,在反应温度由室温(25℃)上升至高温(94~95℃)过程中,可能发生引物错配和二聚体的形成。引物与模板中一些非靶位点的错配和引物之间形成的二聚体,在Taq酶的作用下均可延伸,这些非特异性产物又可以在后面的PCR循环中继续扩增,使非特异性产物不断积累,同时,也消耗反应体系的各成分,最终PCR扩增的特异性产物大大减少。热启动PCR(hot start PCR)是指DNA聚合酶只有在样品温度至少超过70℃时才发挥作用的PCR。通过这种方式控制PCR反应的必须组分DNA聚合酶,直到反应混合物被加热到可以阻止非特异引导和引物聚合的温度后,再启动PCR达到有效扩增特异性PCR产物的目的。

 

       热启动PCR循环是这样的,为了充分激活酶,比普通PCR增加了热激活步骤。

 

循环步骤 温度 时间 循环
起始热激活 95℃ 12-15min 1
变性 95℃ 15-30s 26-35
退货 50-68℃ 30-60s
延伸 72℃ 1-4min
终末延伸 72℃ 5-10miin 1

       PCR的灵魂—热启动DNA聚合酶

 

       与TaqDNA酶不同,热启动DNA聚合酶是经过化学修饰的Taq酶,常温操作时其没有活性,只有高温才能激活酶,可以避免低温或者常温操作时非特异性扩增以及引物二聚体的产生。这款Solis 热启动 FIREPol DNA 聚合酶更灵敏,特异性更强,可以常温操作,常温稳定1个月。同时,PCR产物可以无忧做下游实验DHPLC和TA克隆。

 

热启动PCR-第一款

 

热启动DNA聚合酶组合套装(货号# 01-02-xxxxx)

 

       给你最大自由度的一款PCR组合,它的组分有:

 

       1.热启动DNA 聚合酶

       2.反应buffer1---10x 反应液B1(不含Mg2+和去污剂)

       3.反应buffer2---10x 反应液B2 (不含Mg2+)

       4.25 mM MgCl2

       5.10x Solution S

 

       细心的同学已经发现,为什么一般的PCR体系只有一个buffer,而这个却有两个?

 

       小编为你解密啦!之所以包含两款Buffer 是为广大用户考虑的,如果你的样本不需要去污剂,或者需要自由调整Mg2+浓度,这款给你最大自由度 ,可以按照您实验需求调整方案。而这款套装的最大的宝藏是组分Solution S,常规PCR不需要它,但是如果你遇到扩增困难的模板,或者高GC含量模板,10x Solution S 就要登场啦,并且你可以根据需要调整它的工作浓度,1×,2×,3×.

 

       漂亮的数据告诉你它有多好!

       

       数据显示HoT FIREPol®热启动DNA酶可以很好的扩增基因组DNA片段

 

       

       扩增人基因组DNA的4个片段:1,2为HoT FIREPol®DNA聚合酶;3,4为竞品A公司;5,6为竞品B公司。

 


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