甲基化特异性 PCR 确定 DNA 甲基化的模式
用 PCR 来分析 DNA 甲基化的方法可以运用于：（1）对基因组中任何位置的 CpG 甲基化的分析；（2）检测肿瘤患者的基因改变以及介人被印的基因的固定遗传障碍的研究。
| 实验方法原理 | DNA甲基化（DNA methylation）是最早发现的修饰途径之一，大量研究表明，DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而控制基因表达。 |
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| 实验材料 | |
| 试剂、试剂盒 | NaOH对苯二酚重亚硫酸钠矿物油DNA Wizard cleanup kit (Promega) 或等同物异丙醇糖苷配糖基乙酸胺乙醇10 X PCR 扩增缓冲液4dNTP 混合物Taq DNA 聚合酶 |
| 仪器、耗材 | |
| 实验步骤 | 1.把样品 DNA(达 1ug) 稀释到 1.5 ml 微离心管中的 50ul 水中。如果使用的 DNA 更少（包括从石蜡包被的样品提取的 DAN)，预期的产量少（如很微弱的条带）或者增加循环次数提高产量。准备好阳性和阴性对照 DNA 的稀释液和样品平行进行以下步骤。 2.加入 5.5ul 2mol/L NaOH。37°C，孵育 lOmin。加入 3u1 新鲜配置的 l0mmol/L 对苯二酚和 520ul 新鲜配置的 3mol/L 重亚硫酸钠。混勻并加入足量的矿物油（约 50ul) 用以覆盖水相。50°C 孵育 16 h。 3.除去油。加入 1ml DNA Wizard 试剂，把混合物加到试剂盒带有的 niiniprep 柱。真空处理。用 2ml 80% 异丙醇洗。把柱子置于一个干净的 1.5 ml 管，加入 50ul 60~70°C 的水。离心管子和柱子 1min。每管加入 55ul 3mol/L NaoH，室温孵育 5 min。 4.加入 1ul 10mg/ml 糖苷配糖基，然后加入 17ul 10mol/L 乙酸胺和 3 体积 100% 的冰冻乙醇。-20°C，沉淀 DNA 几小时或过夜，离心 20 mm，去上清，用冰冻的 70% 的乙醇清洗，加入 20~30 ul 水溶解。处理单链 DNA 要像处理 RNA—样（冷冻，尽量减小反复冻融，可能的话保存在-70℃。 5.进行甲基化和非甲基化反映所要分析的样品的数目，包括阳性和非 DNA 对照。准备好甲基化和非甲基化 PCR 反应（50ul) 的主要反应混合物，包括： 5ul 10XPCR 扩增缓冲液； 2.5ul 25 mmol/L 4dNTP 混合物； 1ul 300ng/ul 的有义引物； 1ul 300ng/ul 的反义引物； 28.5ul 水。 混匀。 6.取 3.8ul 主要反应混合物到标记的 PCR 管。每管加人 2ul 重亚硫酸钠修改的 DNA 模板（第 4 步）。如果需要，每管加入 25~50ul 的矿物油，放入热循环仪。PCR 从 95°C 变性 5 min 开始。 7.对每个样品，取 1.25U Taq DNA 聚合酶稀释到 10ul 无菌蒸馏水中。通过油层加入到 40ul 混合物中，并轻轻地吹打。也可以选择用其他形式热启动 PCR。按如下所示继续 PCR 扩增。 35 个循环： 30s 95℃ (变性) 30s 不同的引物温度不一样 (退火) 30s 72℃ (延伸) 最终步骤： 4°C 保存反应产物直至分析。 8.准备 6%~8%(m/V) 非变性聚丙烯酰胺胶，用 1 X TBE 缓冲液作溶剂（单元 7.2)。10V/cm 跑垂直胶 1?2 h，每个样品的反应产物在相邻的泳道，这样可以对甲基化和非甲基化位点之间进行直接的比较。包括阳性和阴性对照。 9.用溴化乙键染胶，在 UVtransilluminator 观察并对胶进行拍照（附录 3G)。一般情况下，产物的范围是 80~200bp。 展开 |
| 注意事项 | 一般情况下，产物的范围是 80~200bp。 |
| 其他 | 来源于精编人类遗传学实验指南，第十章 |
