HLA基因分型方法:PCR-RFLP法
PCR-RFLP法
1)提取细胞总DNA
方法同前。
2)PCR扩增引物的设计
1.引物长度一般为15~30bp,G+C含量应在45%~55%之间。
2.应避免连续出现4个以上的单一碱基。
3.不能含有自身互补序列。
4.两个引物之间不应有多于4个的互补或同源碱基,不然会形成引物二聚体。
5.与非特异扩增序列的同源性应小于70%,或少于连续8个互补碱基。
6.扩增HLA-D区基因多态性区段的引物应在该区第二外显子或高变区的边缘。
3)PCR扩增
1.每100μl反应体系中分别加入:缓冲液10μl,引物各25pmol,DNA 1~2μg,10μl dNTPs,混合均匀后在95~97℃变性5~10min。
2.加Taq DNA聚合酶2U,液体石蜡50μl覆盖放置水分蒸发,将样品置PCR扩增仪中完成扩增反应,变性,退火,延伸温度时间及Mg2+的浓度随扩增引物及区段的不同而改变。
4)限制性内切酶消化
取5μl PCR产物分别用2个单位限制性内切酶(如HinfI)在总体积为12μl的反应体积中酶解,37℃保温2~3h。
5)凝胶电泳
12%聚丙烯酰胺凝胶电泳,200V,3h,用0.5μg/ml溴化乙锭(EB)染色30min,照相分析图形。
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