应规范下呼吸道感染微生物检验的标本采集及报告方式
病原学诊断是感染性疾病诊断的金标准，只有了解病原学和药敏结果，才能真正做到选择正确的抗菌药物和合理用药，同时避免细菌耐药的发生。最终可节省医疗花费，减少住院时间，降低病死率[1]。而病原学诊断结果的正确与否，关键在于标本管理，直接影响治疗策略及疗效、实验室成本和效率。因此，临床医护人员应知晓微生物室对标本采集和运送要求，实验室也应满足医生的需求，提供准确、有临床意义的结果[2]。
目前，国内临床微生物室每日接收最多的标本是痰细菌培养，可占日工作量的一半甚至更多。然而，痰标本并不是诊断细菌性肺炎的最佳标本，痰标本在某种程度上都有口咽部正常菌群的污染[3,4]，而血培养、支气管肺泡灌洗液(BAL)则更能提供可信的病原菌信息，但由于BAL标本的采集需侵入性操作，有些患者不适合或依从性差，最方便易取的还是痰标本。下呼吸道标本的采集和送检要求都不尽相同，标本质量对后续检验质量影响非常大。如果说对"垃圾"标本做检验，得出的一定是"垃圾"结果[2]。因此，临床了解实验室如何规范下呼吸道细菌感染标本的质量及选择报告结果非常重要。
一、下呼吸道感染做细菌学检验的标本及项目[5]
1．纤维支气管镜采集的标本：
经纤维支气管镜获取的BAL和保护毛刷标本(PSB)适合做细菌定量培养，当潜在致病菌的菌落数大于阈值时，其诊断下呼吸道感染的特异度可达82%～91%，诊断价值远高于痰标本。对于机械通气相关肺炎、免疫低下患者肺炎、慢性阻塞性肺病(COPD)、ICU病房重症患者、经抗菌药物治疗未获改善者、艾滋病患者、痰检阴性、疑似肺结核或支气管结核者等情况下，医生选择采集送检。
BAL适用于检测条件致病菌引起的肺部感染的所有试验，推荐做定量细菌培养、分枝杆菌和真菌培养、抗酸染色和革兰染色、直接荧光抗体法检测病毒、肺孢子菌等检测。PSB标本只用于诊断细菌性肺炎，推荐做定量细菌培养和革兰染色。
支气管灌洗液(BS)来自主气道，含上呼吸道污染菌，更适合诊断由严格致病菌引起的肺炎，如结核分枝杆菌、军团菌属、内源性真菌，推荐送检分枝杆菌培养、真菌培养，革兰染色、抗酸染色，直接荧光抗体法检测军团菌和肺孢子菌。
2．诱导痰标本：
适于检测卡氏肺孢子菌和结核分枝杆菌，对其他病原菌检出效果差，不用于细菌培养。
二、标本留取和运送的要求
1．纤维支气管镜标本的采集要求：
纤维支气管镜可采集到感染部位的标本，包括BAL、BS、PSB及支气管穿刺活检标本，均应由呼吸科医师或经培训医师采集；为防止污染，应采用吸入麻醉剂，勿从支气管镜的工作腔中吸取灌洗液标本；标本采集顺序为：BS、BAL、PSB和活检标本，应避免带血。
2．痰、气管吸出物标本的留取：
当有下呼吸道细菌感染指征时，患者在医护人员的指导下先用无菌生理盐水漱口，可减少口腔污染菌的数量，如有假牙应先摘掉；咳出清晨第一口深部痰，留至带螺旋盖的防漏无菌痰杯内[6]。仅当插管患者出现肺炎症状时(如发热或浸润)采集气管吸出物，因气管在插管24
h后即有定植菌，在无肺部感染症状时吸痰送检，培养结果往往与疾病不符[7]。婴幼儿和小龄儿童可吸取气管和支气管的分泌物，常用于诊断细菌性肺炎[2]。
3．标本的运送要求[7]：
临床采集的标本均应尽快送至实验室，实验室对来自急诊、新入院患者和有创方法采集的标本(如：BAL和肺活检标本)要尽快处理，以保证致病菌的活性，避免造成重复采集标本。通常做细菌学检验的标本应在2
h内(室温)送至微生物实验室。延误送检将导致口咽部定植菌过度生长，有临床意义的病原菌数量减少。如需远程运送，建议将标本放置2～8
℃环境(不超过24
h)，但培养分离到肺炎链球菌等苛养菌的机会和数量将会减少。实验室应在报告中对标本延迟送检或经低温冷藏予以说明，并指出可能对培养结果造成的影响。
4．拒收的标本[7]：
实验室接收标本后，首先筛选并拒收以下不合格标本：24
h内重复采集的痰培养标本、唾液、鼻冲洗液和分泌物、鼻孔拭子、咽部标本、未经保护套管收集的支气管刷培养标本及痰的厌氧菌培养标本。除支气管穿刺吸出物、PSB、活检标本、胸水或其他未经污染的标本外，其余类型的标本均不适合做厌氧菌培养。
5．涂片革兰染色判断标本的合格性[5]：
肺部感染的最常见机制是肺泡内吸入了口咽部定植菌，培养方法的局限性在于敏感性低，且无法判断分离菌是感染或定植。因此，实验室需借助涂片革兰染色方法评估痰标本的质量。此外，涂片还可提高下呼吸道感染病原学诊断的特异性和敏感性，并发现培养不能生长的细菌，是既快速又低成本的方法，但需要实验室人员的丰富经验。
通常标本中上皮细胞的数量代表污染程度，白细胞内或外的优势菌(非黏附在鳞状上皮细胞上)有助于预测肺部致病菌。可接受做培养的痰、支气管吸出物标本包括涂片革兰染色所见：(1)<10个鳞状上皮细胞(SEC)/低倍视野(LPF)，大量多形核白细胞(WBC>25个/LPF)，且存在肺泡巨噬细胞和柱状上皮细胞均提示来自深部痰标本；(2)WBC>25个/LPF，SEC<25个/LPF;(3)WBC∶SEC>10∶1，单一形态的细菌量达到3＋～4＋。不适合做培养的判断：当SEC>10个/LPF，提示标本被唾液污染；还包括当吸痰涂片未见细菌时[5]。
6．涂片可提示与感染相关的信息[7]：
通过涂片革兰染色，实验室应报告临床提示感染的信息，虽然由两种致病菌同时引起的感染不常见，但当两种形态的细菌均与白细胞相关时要报告；即使涂片未见细菌时仍有助于评价患者状况，可能隐藏着某些特殊菌，如军团菌、内源性真菌、结核分枝杆菌或其他可引起非典型肺炎的致病菌；质量合格的标本中，涂片有正常菌群及多种细菌(通常白细胞内有空泡或液泡)，特别当培养生长正常菌群时，报告要提示有吸入性肺炎等。
三、对培养结果的报告[7]
阳性培养结果包括对致病菌和可疑感染的定植菌的报告，致病菌一旦分离到就应报告，对定植菌一定要根据涂片找到感染的证据才报告。
1．报告下呼吸道致病菌：
培养分离到化脓链球菌、B群β–溶血链球菌(儿童)、博德特菌属(特别是支气管博德特菌)、奴卡菌属、新生隐球菌，高致病菌包括：弗朗西斯土拉菌、鼠疫耶尔森菌、炭疽芽孢杆菌、丝状真菌(排除腐生菌污染)，均作为下呼吸道致病菌报告。
2．报告可疑定植菌感染：
对于口咽部的定植菌引起下呼吸道感染的判断，需要培养结果和涂片可见该细菌和炎症细胞相关时才报告：(1)例如肺炎链球菌含药敏结果，流感嗜血杆菌、卡他莫拉菌和脑膜炎奈瑟菌含β–内酰胺酶结果；(2)只对住院患者报告铜绿假单胞菌、嗜麦芽窄食单胞菌、鲍曼不动杆菌、洋葱伯克霍德菌，并报告药敏结果；(3)对金黄色葡萄球菌，B群β–溶血链球菌(成人)、C群或G群β–溶血链球菌，单一形态革兰阴性杆菌(特别是肺炎克雷伯菌)，脲酶阳性的棒状杆菌或分离来自ICU的患者的棒状杆菌，分离自免疫抑制患者的马红球菌，当呈优势菌生长时才报告。
BAL和PSB经定量培养，菌落计数分别≥104 CFU/ml和≥103 CFU/ml时具有临床意义，鉴定并报告该细菌和药敏结果[7,8]。
免疫抑制患者是特殊人群，对于免疫正常患者不致病的定植菌，如念珠菌是口腔定植菌，不会引起肺炎，但对肿瘤患者(如：白血病)、肺移植患者或新生儿有意义。
3．对非致病菌的报告：
当仅培养到2种以上的革兰阴性杆菌，实验室只需初步鉴定和报告"肠杆菌科细菌"或"非发酵革兰阴性杆菌"，并不代表有临床意义，应该是定植菌。
实验室对分离到的草绿色链球菌和(或)非致病奈瑟菌、类白喉菌、凝固酶阴性葡萄球菌、罗斯菌属、F群链球菌、厌氧菌、嗜血杆菌属(非流感嗜血杆菌)、艾肯菌属、放线杆菌属、嗜二氧化碳菌、莫拉菌属、肠球菌属、酵母样真菌，未达到有意义数量的金黄色葡萄球菌、革兰阴性杆菌及脑膜炎奈瑟菌，均报告"分离到口咽部正常菌群"
[7]。
由于选择的培养方法不支持病原菌生长、抗菌药物影响、标本送检时间延长、口腔正常菌群污染等可导致假阴性结果出现；而污染菌对标本检测结果的影响以及过度解读细菌学结果等可导致假阳性报告。
四、实验室与临床的沟通和配合
为了保证分析前标本采集的质量，建议当医师向患者交代医嘱不到位时，护士能有效补充；患者留取咳痰标本时要有医护人员在场监督[9]。如果实验室检测无临床价值的标本，必将误导临床治疗，同时也耗费实验室过多的宝贵资源，实验室应拒绝培养不合格的痰标本，并通知临床重新采集标本送检[2]；应提供给临床最新版标本采集手册，并定期去临床各科室进行标本采集和运送的培训。然而，现状是不合格标本送检率高，很多实验室不敢拒收，担心临床不再送标本，这是临床和实验室沟通不畅的表现，且严重影响了实验室的检验质量。
以上主要内容已编入2013年立项的卫生行业标准《下呼吸道感染细菌培养操作规范》，并已通过国家卫生计生委员会临床检验标准化委员会的批准，将在近期出版，以规范微生物实验室的操作。实验室应依据相关指南进行操作和报告，在必要时与临床积极沟通；对于实验室报告的结果，临床还需结合患者的病情分析是否予以采纳。终归正确的微生物检验报告是始于合格的标本。
参考文献
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