siRNA个人经验小结
在活体RNAi关键点：类似药物属性的引入，如稳定性、细胞内的传送、组织的生物可溶性进入合成的siRNA。
授予siRNA类似药物的属性
化学稳定性的胆固醇共聚的siRNA 显著的改善了其在体内和体外的药物属性。
化学稳定性增强的方法：对正义和反义链进行部分的phosporothioate backbone和 2’－O－methyl sugar 修饰，增加其在血清中和组织匀浆中对核酸内切酶和外切酶的抗性。
在反义链的3’ 端引入两个2’－O－methyl核苷酸。
增强其药物属性的方法：在正义链3’ 端通过一个pyrrolidine linker与胆固醇相连接，由于在3’ 端的连接并不改变其siRNA的活性，而且使其能够与HAS特异性的结合（human serum albumin）并且增强了其在血清中的稳定性。
核酸的生物分布：通过对siRNA的RPA分析来确定。
siRNA进入体内的方式：通过尾静脉注射
生物效应的确定：
1. 确定基因是否表达？在何种组织中特异性表达？
2. 试用RT-PCR和Western blot或者免疫组化来确定
siRNA干扰基因表达应该考虑的一些效应：
1.是否是特异性的，而非off－target效应、干扰素效应造成的。
2.siRNA特异性可以用不同的siRNA针对基因不同区域
3.设置阳性对照组，可以设置多个阳性对照组，并且通过GAPDH进行normalization处理
4.设置mismatch对照组
确认siRNA在体内的作用机制
通过5’ RACE来确认特异的mRNA断裂产物，已经在植物和小鼠胚胎中采用方法确定了miRNA指导的mRNA的断裂，此种方法是用来确认是RNAi机制的作用引起目的基因的抑制。
总的来看siRNA干扰都有相应的剂量效应。
推荐
