沙门氏菌探针检测法的检测过程
1、样品制备
①前增菌 在非选择性培养基中对试样进行前增菌使沙门氏菌开始生长。前增菌方法因产品类型而不同,但必须按 AOAC967.26A 或《细菌分析手册》现行版执行。
②选择性增菌 按常规培养方法分别移取培养后的前增菌的培养物1mL 转种于装有10mL 亚硒酸盐胱氨酸肉汤管中(预热至35℃)和装有10mL 四硫磺酸盐肉汤管中(预热至35℃)于35℃培养6h 但下列食品除外。
生食品和含有高浓度杂菌的食品:将亚硒酸盐胱氨酸和四硫磺酸盐肉汤用于35℃培养18h±2h。
③后增菌 从培养箱中取出选择性增菌培养物,用手或涡旋混合器混合。移取1mL四硫磺酸盐培养物转种到装有10mLGN 肉汤管中(预热至35℃)移取1mL 亚硒酸盐胱氨酸培养液转种到另一支装有10mLGN 肉汤管中(预热至35℃)GN 肉汤于35℃培养12～18h。生食品和含有高浓度杂菌的食品除外。将四硫磺酸盐和亚硒酸盐胱氨酸管放回35℃培养箱,培养至总计24h±2h。
生食品和含有高浓度杂菌的食品:于35℃培养 GN 肉汤6h。将四硫磺酸盐和亚硒酸盐胱氨酸管放回35℃培养箱,培养至总计24h±2h。
2、DNA杂交分析
①将水浴锅充水至4cm,温度调到65℃±1℃。
②准备细胞溶解液 加6mL 溶解剂缓冲液到浓缩细胞溶解剂瓶中,轻摇至完全溶解置于冰上。(注意:溶解后的细胞溶解液贮存于-20℃下可保持60天。在室温化冻,化冻后应置于冰上。使用后马上将未用完的溶液回到-20℃。)
③每检测25份样品准备1L 1倍洗液50mL20倍洗液加950mL蒸馏水或去离子水。
④每检测25份样品准备一个含有300mL1倍洗液的金属洗涤槽,盖上盖置65℃水浴备用。
⑤每检测25份样品另准备两个含有新鲜的300mL 1倍洗液的洗槽,盖上盖置室温备用。
⑥标记足够数量的12mm×75mm 玻璃试管每次检测包括1个阳性对照管和1个阴性对照管。将试管放在每排5孔的试管架上。
⑦将适当数量的测杆放入测杆支架上。置于1倍冲洗液(室温)中备用。
⑧从35℃培养箱中取出样品 GN 肉汤。涡旋混合或以其他方式混合每一培养物。每一样品从2管 GN 肉汤(一管源于四硫磺酸盐,一管源于亚硒酸盐胱氨酸)中分别移取0.25mL 放入单个试管中。在数据表上记录样品的编号。
⑨混匀阳性和阴性对照液。移取0.5mL 阳性对照液放人阳性对照管中,移取0.5mL 阴性对照液放入阴性对照管中。将对照液放回2～8℃贮存。
⑩加0.10mL 细胞溶解液于每一试管中,用手振摇试管架5s,于室温下培养试管5min。(注意:加入溶解液后,应致使溶液呈现蓝色,若任何管均不呈现蓝色,重新检查是否加入了溶解液。)
⑪将试管架放入65℃水浴中,加0.20mL 探针溶液于每一试管中,用手振摇试管架5s 将探针溶液放回2～8℃贮存。(注意:加人探针溶液后,溶液将有明显的颜色改变,若没有出现颜色变化,重新检查是否加入探针溶液。)
⑫用吸水纸吸干测杆外的水渍(用手拿测杆柄的顶部)。将测杆放入试管内,上下5次混匀试管内容物。将含有测杆的试管置65℃培养1h。
⑬准备第二个放置12mm×75mm试管的试管架,作好标记。
⑭足量的1倍酶接合剂的制备,按1:100混合浓缩的酶接合剂和1倍冲洗液。分装0.75mL1倍酶接合剂于每一空管中。将剩余的100倍浓缩的酶接合剂放回到2～8℃贮存。
⑮将测杆从试管内取出,在65℃洗液中轻轻涮洗1min。
⑯用吸水纸吸去斑渍,把测杆放在含有酶结合剂的第二个试管内,室温培养20min。
⑰准备第三个试管架并作好标记,包括附加的空白管。
⑱分装0.75mL酶底物-色原到每一空管。将剩余的酶底物-色原溶液放回2～8℃贮存。(注意:分装好的酶底物-色原溶液在使用前应达到室温,至少放置5min)。
⑲从酶接合剂管中取出测杆,于室温下新配制的冲洗液中轻轻涮洗测杆1min。
⑳在吸水纸上将测杆吸干。将测杆放入装有酶底物色原管的第三个试管架上,在室温下培养20min。
㉑从试管中取出测杆并弃去。加0.25mL 终止液于装有酶底物色原的每一试管中,包括空白用手振摇试管架使内容物混合。
㉒在450m 处测量吸收值 A。将参比管放在光度计左边的参比室中,将试样管放在光度计右边的样品室中,读出每管的吸收值。吸收值将会以数字显示出来。待读数器稳定后方可在数据表上记录每一管的结果。
a.将标有“空白”的试管放入光度计左边的参比室中,阴性对照管放入光度计右边的样品室中,测定阴性对照的吸收值。
b.将标有“空白”的试管放入光度计左边的参比室中,阳性对照管放入光度计右边的样品室中,测定阳性对照的吸收值。
c.将阴性对照管放入光度计左边的参比室中,待测样品管放入光度计右边的样品室中测定待测样品的吸收值。
3、数据分析
①阴性对照 A 应为≤0.15(以空白作对照读取)。
②阳性对照 A 应为≥1.00(以空白作对照读取)。若未得到这些结果,应重新进行检测。
阴性标准如果 A≤0.10(以阴性对照作对照读取),则待测试样可判定为阴性(无沙门氏菌存在的反应)。
阳性标准如果 A>0.10(以阴性对照作对照读取),则待测样品可判定为阳性(有沙门氏菌存在的反应)。
4、DNA杂交阳性结果的确证
经 DNA 杂交分析检出的阳性样品必须用标准的培养法加以确证。除极少的情况外,仅以GN 肉汤培养物用于确证,而四硫磺酸盐肉汤和亚硒酸盐胱氨酸肉汤培养物应被保留(2～8℃),用于 GN 肉汤不能确证的情况。按常规标准培养方法将培养物划线于 HE,XLD 和BS 平板,将典型和可疑菌落按经典方法进行生化和血清学鉴定。
