沙门氏菌DNA探针检测法的基本要素
1、原理
用特异性的 DNA 探针进行沙门氏菌核糖体 RNA(rRNA)的检测。待检样品经前增菌、选择性增菌和后增菌后,溶解细菌。加入标记好的沙门氏菌特异性的 DNA 探针用于液相杂交。如果待检样品中存有沙门氏菌 rRNA,荧光素标记的检测探针和多聚脱氧腺嘌呤核苷酸(polydeoxyadenylic acid,poly dA)末端捕获探针将与目标 rRNA序列进行杂交。然后把包被有多聚脱氧胸腺嘧啶核苷酸(polydexythmidylic acid,poly dT(固相)的测杆插入杂交溶液。 poly dA 和poly dT之间进行碱基配对,便于探针捕获:目标杂种核酸分子结合在固体载体上,未接合的探针被冲洗掉。测杆被培养在辣根过氧化物酶抗荧光素接合剂中。接合剂与存在于杂交检测探针上的荧光素标记物结合,未结合的接合剂被冲洗掉。并将测杆培养于酶底物色原溶液中,辣根过氧化物酶与酶底物反应,将色原转变为蓝色化合物。一旦遇酸反应便停止,色原的颜色变为黄色在450nm处测量吸收值,吸收值大于临界值则表明在待检的样品中存有沙门氏菌。
2、仪器
①光度计 在450nm 处测量吸收值。能容纳装有1mL 溶液的12mm×75mm 试管的空白和样品槽。
②试管架 需要3个。塑料的、耐热(65℃),至少可容纳12mm×75mm试管50支。最少5个槽/排,槽与槽间隔18mm(从两槽的中心测量)。
③测杆支架 每排可支持5个测杆的塑料装置。每个测杆之间的间距为18mm(中心一中心)。
④冲洗槽 需要4个金属的或塑料的耐热(65℃),10cm×10cm×9cm 带盖容器⑤试管 12mm×75mm 玻璃试管。
⑥恒温水浴 能于65.0℃±1.0℃ 恒温。能容纳1个试管架和1个冲洗槽。水位5cm。
⑦可重复使用的移液器 任选,具有注射器一吸水管尖头。能精确地吸移0.1mL,0.2mL,0.25mL和0.75mL。也可用血清学移液管代替。
3、试剂
①浓缩细胞溶解剂 冻干蛋白酶 K。
②细胞溶解剂缓冲液 5%sakosyl,0.0025mol/L乙二胺四乙酸二钠,0.26mol L Tris,0.08%溴酚蓝水溶液。
③探针溶液 荧光素标记的、沙门氏菌特异性的、合成的低聚核苷酸 DNA 探针和在pH7.5 1.05mol/L Tris,0.5mol/L 乙二胺四乙酸二钠,0.05%牛血清白蛋白,0.05%NP40(无离子洗涤剂),0.025%甲酚红和0.05%叠氮钠中的 polydA-末端、沙门氏菌特异性的、合成的低聚核苷酸 DNA 探针。沙门氏菌探针必须显示出其特异性并与其他肠杆菌科和其他细菌无交叉反应。通过检测在 GN 肉汤中35℃生长18～24h 的与沙门氏菌具有高同源性的非沙门氏菌的纯培养物(未经稀释)来测定其特异性。合适的特异性检验方式应包括可能存在于食品中所有沙门氏菌亚属的多种典型菌和其他菌群的典型菌,特别是其他肠杆菌科的细菌。
④20倍浓缩的冲洗液 含有1.0mol/L Tris,pH7.5;0.4mol/L乙二胺四乙酸二钠:3.0mol/L 氯化钠和0.2%吐温-20。
⑤酶接合剂 100倍浓缩的辣根过氧化酶抗荧光素多克隆抗体接合剂。
⑥酶底物-色原溶液 尿素过氧化物、四甲基联苯胺、9%二甲亚砜、9%二甲基甲酰胺。
⑦终止液 2mol/LH2SO4。(当心:腐蚀剂,避免与皮肤接触。若一旦接触,用冷水彻底地冲洗皮肤。)
⑧测杆 聚苯乙烯测杆,8cm(5cm 手柄,3cm臂。臂有5个包被poly dA的浆状的突起物,包被 poly dT 的测杆的结合能力应大于250ng poly dA。应检测测杆与其他试剂的基质结合的能力以保证固有的方法的灵敏度。
⑨阳性对照液 甲醛灭活的鼠伤寒沙门氏菌。当检测试样时,其浓度足以产生≥1.0的吸收值。所用的有效的菌体浓度可随其制备时所用的菌株、培养基和条件而变化。
⑩阴性对照液 甲醛灭活的弗劳地枸橼酸杆菌当杂交和/或冲洗温度<64℃时,在试样中足以产生>0.15的吸收值,正确地进行检测,阴性对照液应产生≤0.15的吸收值。所用的有效菌体浓度可随其制备的菌株、培养基和条件而变化。
⑪GN肉汤 20g胰蛋白胨、1g葡萄糖、2.0g甘露醇、5g枸橡酸钠、0.5g去氧胆酸钠、1.5g磷酸二氢钾、4g磷酸氢二钾、5g NaCl。溶解各成分于1L H2O中,分装于16mm×125mm试管中,每管10mL。旋松试管帽,于121℃高压灭菌15min在25℃时,最终pH值应为7.0±0.2。
⑫诊断试剂 必要时,用于 DNA 杂交分析阳性的培养物的确证。见常规培养鉴定方法。
①～⑪项可从 GENE-TRAK 系统购得。用作沙门氏菌 GENE-TRAK 比色检测(用于沙门氏菌检测的DNA杂交实验)。于2～8℃贮存浓缩细胞溶解剂、探针溶液、100倍浓缩的接合剂、酶底物-色原溶液、阳性对照液和阴性对照液。细胞溶解剂在用溶解剂缓冲液溶解后,贮存于-20℃。在室温下(<30℃)贮存所有其他溶液和测杆。
4、通则
每组检样测试包括1个阳性对照和1个阴性对照。
不要用手指触摸测杆的尖部,仅握住手柄;不要重复使用测杆和冲洗液。
每一样品和试剂需用单独的移液器或吸嘴,以避免交叉污染。注意不要用酶接合剂污染酶底物-色原混合物。用后应按要求立即放回到2～8℃冷藏。参照每个试剂瓶上标明的要求贮存。
接触细菌培养物的所有器材均作为生物有害物质加以处理,并用适当的方法消除其污染。
(注意:探针溶液含有0.1%叠氮钠。该试剂的废弃物倒入洗槽中时,应立即用大量的水冲洗以避免与自来水管中的铜或铅化合物形成爆炸性的残留物)。
