等电聚焦电泳色谱仪分离技术介绍（一）
等电聚焦电泳色谱仪是利用蛋白质分子或其它两性分子的等电点不同，在一个稳定、连续和线性的pH梯度中进行分离。按pH梯度的形成原理不同可分为载体两性电解质pH梯度等电聚焦电泳和固相pH梯度等电聚焦电泳。
一、载体两性电解质pH梯度等电聚焦电泳：
1、理想的载体两性电解质应具备的条件：
载体两性电解质是两性分子，使其在电泳柱中能达到一个平衡位置。载体两性电解质可作为载体，但两性电解质不能用于等电聚焦。只有载体两性电解质，即具有好的导电和缓冲能力的化合物才能用于等电聚焦。
（1）易溶于水，在pI处应有足够的缓冲能力，形成稳定的pH梯度，不致被蛋白质或其它两性电解质改变pH梯度。
（2）在pI处应有良好的电导和相同的电导系数，以保持均匀的电场。
（3）分子量小，易与被分离物分开。
（4）化学性能稳定，与被分离物不起化学反应，也无变性作用，其化学组成不同于蛋白质。
2、蛋白质的等电点（pI）：
蛋白质最主要的特性是它的带电行为，在不同的pH环境中带不同数量的正电或负电，只是在某一pH时，蛋白质的净电荷为零，此pH即为该蛋白质的等电点（pI）。蛋白质的等电点取决于它的氨基酸组成和构象，是一个物理化学常数。
3、载体两性电解质pH梯度的载体：
常用载体是聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶和葡聚糖凝胶等，其中聚丙烯酰胺凝胶最为常用。
4、载体两性电解质pH梯度的介质：
一般采用氨基酸和氨基聚合羧酸的缓冲液。
5、载体两性电解质pH梯度的形成：
等电聚焦电泳的关键是pH梯度的形成，载体两性电解质pH梯度的介质是两性分子，在电场中迁移到自己的等电点后自然形成pH梯度。
在没有电场时，载体两性电解质的pH值约是该溶液pH范围的平均值，所有载体两性电解质分子都荷电。
当引入电场时，载体两性电解质分子将向阴极或阳极迁移，带有最低等电点的分子（荷负电zui多）将zui快地向阳极移动，当它达到净电荷为零的位置时才停止，这个位置靠近阳极，由于它具有高的缓冲能力，使环境溶液的pH等于分子本身的pI。一些低pI的载体两性电解质（荷负电次多）也向阳极移动，直到它的净电荷减少到零时才停止。同样，其周围环境溶液pH值也等于它本身的pI。依次类推，所有的载体两性电解质分子用增加pI级数的方法将分别在阳极和阴极之间到达自己的位置，从而形成pH梯度。
6、工作原理：
蛋白质的等电点取决于其氨基酸的组成。组成每一种蛋白质、多肽的氨基酸的数目和比例不同，蛋白质的等电点范围很宽。在电泳仪中加入载体两性电解质，通直流电时，载体两性电解质即形成一个由阳极到阴极逐步升高的pH梯度。蛋白质进入时，不同的蛋白质移动到与其等电点相当的pH位置上，从而使不同等电点的蛋白质得以分离。
7、特点：
（1）优点：
1）属于非变性蛋白质分离技术。
2）分辨率高，区带清晰且窄，分辨率至少可达0.01 pH单位。
3）受溶质扩散影响小，可消除分子扩散引起的分离度下降。
4）加样部位自由，重现性好。
5）操作简单，电泳速度快。
6）可测定蛋白质和多肽的等电点。
7）分离在较低的工作电压下（20V/cm）进行，可避免蛋白质上专一结合（以共价键等强作用力结合，一定程度上依赖于蛋白质构象）的金属在电场作用下丢失。这部分金属大多构成蛋白质的活性中心或结构中心，比非专一结合金属具有更重要的生物学意义。
（2）缺点：
1）载体两性电解质合成过程复杂，影响蛋白质点的位置，从而影响重复性。
2）凝胶灌制重复性差，影响结果重复性。
3）负极漂移现象使pH梯度不稳定。
4）负极漂移现象使碱性蛋白质无法聚焦。
5）需无盐溶液，不适用于在等电点不溶解或发生变性的蛋白质。
6）载体两性电解质的加入对产品产生污染。
7）操作过程中易发生凝胶脱水起皱现象。
