格里斯试剂比色法测定食品中的发色剂
亚硝酸盐测定采用盐酸萘乙二胺法,又称格里斯试剂比色法。
1. 测定原理
样品经过沉淀蛋白质、去除脂肪后,在弱酸条件下亚硝酸盐与对氨基苯磺酸重氮化,再与盐酸萘乙二胺偶合形成紫红色染料,其最大吸收波长为538nm,且色泽深浅在一定范围内与亚硝酸盐含量呈正比,可与标准系列比较定量。
2. 试剂
① 亚铁氰化钾溶液 称取106.0g亚铁氰化钾[K4Fe(CN)6·3H2O],用水溶解,并稀释至1000mL。
② 乙酸锌溶液 称取220.0g乙酸锌[Zn(CH3OO)2·2H2O],加30mL冰乙酸溶于水,并稀释至1000mL。
③ 饱和硼砂溶液 称取5.0g硼酸钠(NaB4O7·10H2O),溶于100mL热水中,冷却后备用。
④ 对氨基苯磺酸溶液(4g/L) 称取0.4g对氨基苯磺酸,溶于100mL20%盐酸中,置棕色瓶中混匀,避光保存。
⑤ 盐酸萘乙二胺溶液(2g/L) 称取0.2g盐酸萘乙二胺溶解于100mL水中,混匀后置棕色瓶中,避光保存。
⑥ 亚硝酸钠标准溶液(200μg/mL) 准确称取01000g于硅胶干燥器中干燥24h的亚硝酸钠,加水溶解后定容到500mL。
⑦ 亚硝酸钠标准使用液(5.0μg/mL) 临用前,吸取亚硝酸钠标准溶液5.00mL,置于200mL容量瓶中,加水稀释至刻度。
3. 仪器
小型绞肉机;分光光度计。
4. 操作方法
(1)样品处理 称取5.0～10.0g粉碎混匀的样品,置于50mL烧杯中,加12.5mL硼砂饱和液,搅拌均匀,用约300mL70℃左右的热水将样品洗入500mL容量瓶中,于沸水浴中加热15min,冷却至室温。边转动容量瓶边加入5mL亚铁氰化钾溶液,摇匀,再加入5mL乙酸锌溶液,以沉淀蛋白质。加水至刻度,摇匀,放置0.5h,除去上层脂肪后过滤,弃去初滤液,滤液备用。
(2)测定 吸取40.0mL上述滤液于50m具塞比色管中,另取0.0mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL、1.5mL、2.0mL、2.5mL亚硝酸钠标准使用液(5.0μg/mL),分别置于50mL具塞比色管中。于标准管与样品管中分别加入2mL对氨基苯磺酸溶液(4g/L),混匀,静置3～5min后各加入1mL盐酸萘乙二胺溶液(2g/L),加水至刻度,混匀,静置15min,于波长58nm处测吸光度,并绘制标准曲线。同时做试剂空白实验。
5. 结果计算
式中 X——样品中亚硝酸盐的含量,mg/kg;
m——样品质量,g;
m'——测定用样液中亚硝酸盐的质量,μg;
V1——样品处理液总体积,mL;
V2——测定用样液体积,mL。
6. 讨论
① 本方法为国家标准法GB/T5009.33—2003标准方法,亚硝酸盐最低检出限为1mg/kg。
② 亚铁氰化钾和乙酸锌作为蛋白质沉淀剂,使产生的亚铁氰化锌沉淀与蛋白质产生共沉淀,蛋白质沉淀剂也可采用硫酸锌溶液(30%)。
③ 饱和硼砂溶液的作用:亚硝酸盐提取剂,同时也是蛋白质沉淀剂。
④ 对于含油脂多的样品,可去提取液中的上层脂肪;对于有色样品可用氢氧化铝乳液脱色后再进行显色反应。
⑤ 本测定用水应为重蒸馏水,以减少误差。
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