细胞因子与实体瘤的免疫基因治疗（二）
许多细胞因子基因由于其抗肿瘤效应被评估用于临床前和临床的试验，一些比较常见的包括IL-2, IFN-α, β, γ, IL-12, IL-15, GM-CSF and TNF-α。
基因导入方式主要有两种方式：1)直接注射基因治疗载体到肿瘤组织和其边缘(106)；2)把在体外细胞因子基因修改过的自体的或异源的成纤维细胞、干细胞或其他类型正常细胞植入肿瘤组织或边缘区(106)。
GM-CSF 基因修饰疫苗在临床试验中带来早期的希望
除了以上两种细胞因子基因治疗方法外，第三种基因/细胞因子治疗方法是用体外修饰过的自体或同种异体的和经辐射杀死的肿瘤细胞作为疫苗。各种免疫刺激细胞因子基因被导入经处理的肿瘤细胞（主要是通过辐射线照射），作为疫苗注射进癌症患者体内。这种治疗模式实际上是细胞因子基因治疗方法和传统的肿瘤细胞疫苗方法的有力结合，这两种方法在历史上沿着各自的方向发展，知道90年代中期才结合到一起。
与疫苗办法相比较，有少数研究则直接在同一肿瘤模式中应用大量细胞因子诱导预防性的抗肿瘤反应 (107、108)。一个突出有效的细胞因子是GM-CSF。由于这些临床前的效果，不少人类的临床试验已经或正在各种实体瘤和血源性肿瘤开展，包括前列腺癌、肺癌、胰脏癌、白血病、骨髓瘤。GM-CSF转导疫苗实验的主要发起者是美国Cell Genesys公司，该公司的GM-CSF疫苗为GVAXTM系列肿瘤疫苗。迄今为止，GVAX疫苗取得了早期临床试验的成功(109-112)，其中，前列腺癌的疫苗已经进入第三阶段的临床试验，而所有其他疫苗(肺癌、胰腺癌、白血病、骨髓瘤)已在第二阶段试验中取得了积极的疗效。这些结果是令人鼓舞的，因为大部份是高龄、高风险的病例，病人常规治疗失败或可能失败。在今后几年内， GVAX疫苗有可能提供给一些癌症患者。如果属实，这将是首个商业性的基因改造的癌症疫苗。
瘤内注入病毒载体的一个潜在的严重问题是肿瘤组织的病毒"泄露"
从理论上讲，瘤内注入细胞因子编码的基因治疗载体将主要集中在肿瘤组织，这是基因治疗法导入细胞因子优于传统的细胞因子注入方法的最重要方面之一。不过，越来越多的证据表明，局部注入的腺病毒载体并不是集中在注射的部位。事实上，瘤内注射很容易泄漏，腺病毒载体的瘤内注射导致病毒泄漏到肝、肾、肺(113,114)(图1)。
病毒载体的泄漏严重降低了细胞因子基因治疗的优势，因为大部分泄漏的载体可能被肝和其他器官吸收。抗病毒载体的免疫反应和细胞因子的系统性升高增加了毒副作用，甚至宿主的发病率(115)。因此，细胞因子基因疗法要取得成功，就必须采取有效的办法，以确保细胞因子的表达局限于肿瘤组织。
肿瘤特异基因表达是可以通过物理和生物方法实现
一个确保肿瘤基因治疗的有效方法是利用肿瘤特异的"开关"或启动子，限制肿瘤特定基因的表达。这些例子包括：1)生物学上的肿瘤特异的启动子活化机制，例如CEA启动子在结肠和其他类型癌症中是活化的(116,117)；Erb-B2启动子，在乳房癌和其他癌症中是活化的被激活(118)；甲胎蛋白启动子，在肝癌中是活化的(119,120)；前列腺特定抗原(PSA)基因启动子，在前列腺组织是活化的(121)；端粒酶启动子，在90%以上肿瘤和99%以上的正常组织中是活跃的(122).。2)身体上的诱导物，例如电离辐射(123)、热(124,125)。
生物基因疗法的策略往往取决于疾病特定基因活化的鉴定。这种方法已成功应用在一些实验中，但一个主要障碍是要确定个体肿瘤的特异启动子被高水平地激活。另外，该系统的更多障碍是缺乏基因表达的时序控制，因为它们不能被人为地启动或关闭。
外部物理因素在控制基因表达上具有明显的时间与空间优势。电离辐射已成功应用于TNF-α基因表达地空间和时间控制(123)。电离辐射地主要有优点在于疾病部位定向的精确度，不过，它的明显缺点是没有自然存在的启动子，不能对电离辐射产生持续的高水平的反应。公布的数据显示，20Gy单剂量γ辐射诱发的报告基因表达是通常辐射诱导的EGR基因启动子的9倍(126)。
热型的基因调控方法提供了强大细胞因子免疫基因疗法
热型基因调控的方法基于普遍存在的热休克反应/应激反应。这个反应通常在哺乳动物细胞暴露在高于生理温度3-7℃时发生(127)。在热休克反应中，细胞关闭大多数合成蛋白质的合成，并开始合成一类称为热休克蛋白(HSPs)的蛋白质。哺乳动物细胞可将高达90%的蛋白质合成装置用来生产的热休克蛋白(127)，这些蛋白质执行保护功能，如防止关键蛋白质高温变性。部分热休克蛋白通常低水平表达，但在热休克反应中表达量显著升高。这种诱导效应是对照的几百倍甚至上千倍，大部分是通过这些基因的启动子在转录水平调控的。
例如，我们用的热休克蛋白70启动子(HSP70B)是用来控制报告基因(EGFP)表达。高温诱导的表达量超过1000倍(图二)。当应用整合入细胞因子基因的重组腺病毒载体时，TNF-α基因产物在体外达到6.8×105倍，在体内达到835倍。（表1）
Figure 2. Proof of principal for heat induced gene therapy. (A) A graphic representation of hyperthermia-regulated gene therapy. (B) Flow cytometric analysis of 4T1 cells infected with an adenovirus carrying a heat-inducible green fluorescence protein (GFP) gene. The x-axis represents fluorescent intensity and the y-axis represents cell numbers. It is clear that GFP is induced at 39oC. (C) The time course of heat-induced GFP expression in 4T1 cells that have infected with an adenovirus encoding a heat-inducible GFP gene.
最重要的是这个启动子的本底活性非常低，细胞因子的浓度已低于ELISA所能检测的水平。另一项研究表明，启动子的活性可以在初步治疗的多个时段进行调控(128)。这是关键，因为它暗示着治疗基因的水平可被多范围的高温所调控。
低背景加上高诱导能力使得这种启动子成为细胞因子基因免疫治疗的理想启动子。我们以往的研究表明，高温诱导的癌症基因治疗载体比非调控的基因治疗载体有巨大的优越性(113,125)。当数量相当的病毒载体被注入皮下生长的肿瘤内时，能检测到不同水平的非目的基因的表达。对于报告基因在组成性的细胞巨化病毒启动子控制下的载体，可检测到各种器官和组织基因的表达，如肝、肺、脾(图二).
对于整合有热诱导报告基因的载体(如IL-12)，基因表达仅在加热的肿瘤区发现。此外，整合有IL-2基因的热诱导载体被注入瘤内时(剂量为108-109pfu/每鼠)，几乎观察不到毒性。这与腺病毒载体有很大不同，腺病毒载体带有控制IL-2基因的组成性启动子，造成相当严重的正常组织毒性，如脾大、昏睡、甚至死亡。尽管瘤内注入同等数量的重组病毒颗粒，仍会产生严重的副作用。因此，用热诱导的方法调节基因表达有显著优势，它可以限制治疗基因的表达只在目标组织，从而降低了不必要的正常组织毒性。最重要的是，尽管热诱导基因的表达是定向而且受限的，病毒的功效仍然相当可观。在黑素瘤B16F10小鼠模型中的应用表明，热诱导的基因治疗在减少肿瘤生长方面有相当强大的杀伤肿瘤作用(图3)。
Figure 3. Adenovirus mediated, heat-regulated gene therapy in a mouse melanoma model. Experimental tumors were established in syngeneic C57BL6 black mice by implanting 106 B16F10 melanoma cells. Viral injections were carried out 1 week later when tumors grew to sizes of 5-7 mm in diameter. In the shown experiment, four groups of animals were included. These are mice injected with adenoviruses encoding a) a heat inducible EGFP gene alone (??); b) a heat inducible EGFP gene with heat treatment (à); c) the murine IL-12 gene (??) alone and d) the murine IL-12 gene with heat treatment (à ). There were 10 animals in each group. The error bars for all the data points represent the standard error of the mean (reproduced from reference 27 with permission from AACR).
细胞因子基因治疗与放射或化学治疗的结合对克服实体瘤抗免疫系统的作用是必需的
尽管各种免疫治疗策略有巨大前景，但至今很少取得临床的成功。许多研究人员早就知道，在多数情况下单独的免疫治疗不足以消除肿瘤，因为大多数坚实完善的实体瘤已发展了各种机制下调宿主对肿瘤细胞的免疫反应，这些机制包括：1)实体瘤可能被宿主免疫系统视为免疫隔离部位，从而使它们逃脱免疫监视。
通过"免疫编辑"程序，许多肿瘤细胞对免疫系统基本上是沉默的，很多肿瘤已下调免疫刺激的MHC蛋白或者发生TAP-1基因突变，使他们在免疫监视下拥有隐性的表型 (130,131)； 2)肿瘤细胞已建立各种防御武器或障碍，帮助他们对抵免疫系统。例如：某些肿瘤细胞表面表达FAS配体可以杀死T细胞(132,133)，免疫抑制性细胞因子IL-10和TGF-β的表达降低免疫效应细胞的活性；3)许多实体瘤发展出了变形的脉管系统，减少粒性白细胞的外渗(134,135)，从而避免了免疫系统的激活或共同攻击。
由于众多问题，任何形式的免疫治疗尽管有效，但很难通过自身完全除掉实体瘤尤其是晚期的实体瘤。
幸运的是，免疫治疗有一些补救办法。放射治疗就是一种，它在消灭局部肿瘤生长过程中显示了巨大的潜力。放射疗法与细胞因子免疫治疗的结合即是一个办法，这种方法的原理是：第一，辐射可以"地毯式轰炸"的方式杀死大部分肿瘤细胞，去除肿瘤针对免疫系统的防御性武器；第二，辐射可以诱导更多的免疫刺激基因如MHC-I 、MHC-II 、ICAM-I的表达，有利于免疫效应细胞的外渗和激活(136，137)。第三，辐射诱发的凋亡/坏死可提供丰富的抗原，可能刺激杀伤肿瘤免疫反应(138、139页)；第四，刺激免疫系统的综合疗法，可能有助于预防再发性肿瘤在局部成长和肿瘤转移性疾病的根除。
事实上，我们的数据也大大支持了这项综合治疗策略。腺病毒介导的白介素-12(IL-12)基因治疗与放射治疗的结合，与两者单独应用相比，显著增强了抗肿瘤效应(140)(图四)。
化疗与免疫疗法相结合的原理不是那么明显，这是因为化疗优先针对全身的增殖细胞，包括各种免疫效应细胞。因此，一般来说化疗被认为能抑制免疫系统。然而，已经出版的文献报告，化疗与细胞因子基因疗法之间存在协同功效，尤其是较低剂量的应用(141-143)。其确切机制不很清楚。
Figure 4. Synergistic anti-tumor efficacy when an adenovirus encoding constitutively expressed IL-12 and B7.1 (AdIL-12/B7.1) was administered after radiation therapy (RAD). (??) untreated control; (??) injection of control AdGFP on day 7 after transplantation (a. Tx.), no radiotherapy (RAD); (??) injection of AdIL-12/B7.1 on day 7 a. Tx., no RAD; (à ) initiation of RAD on day 7 a. Tx., injection of AdGFP after the last (3rd) RAD fraction; (à) initiation of RAD on day 7 a. Tx., injection of AdIL12/B7.1 after the 1st RAD fraction; (??) initiation of RAD on day 7 a. Tx., injection of AdIL12/B7.1 after the last (3rd) RAD fraction. The virus dose injected was 3 × 108 pfu (in 50 μl PBS) except for the injection after the 3rd radiation fraction in 4T1, when 3 × 107 pfu was used. Error bar represents the mean relative tumor volumes (± standard error (SE)) for different combinations of radiotherapy and adenovirus gene therapy in B16.F10 tumors in C57BL/6 mice. See reference 140 for details.
展望
细胞因子免疫基因疗法进入了一个令人振奋的阶段，许多临床前期以及临床研究显示暗示出它的巨大潜力。在不久的将来它很可能会成为治疗癌症的常规方法，不过显然需要继续研究，以优化施药方式和明确用药的情况。相信大多数细胞因子基因疗法将提供辅助治疗(结合外科、化疗、放射治疗)，主要目的是消除和防止癌症复发和转移。
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Cellular & Molecular Immunology Volume 2 Number 2 April 2005
