常用DAN探针制备的方法介绍--切口平移
切口平移(nick translation)是制备核酸探针的常用方法之一。该方法用 DNase Ⅰ在双链 DNA 内部切开若干个单链切口形成3'-OH 末端,而不打断 DNA 的双链结构;用大肠杆菌 DNA 聚合酶Ⅰ的5'→3'核酸外切酶活性,从游离5'端降解双链 DNA,又因 DNA 聚合酶Ⅰ具有5'→3'聚合酶活性,将游离核苷酸加在3'-OH 端上,使切口沿着5'→3'方向移动,如以放射性同位素或生物素标记的核苷酸置换原先 DNA 链中存在的核苷酸,就可制备出同位素标记探针或生物素标记探针。此外,大肠杆菌 DNA 聚合酶Ⅰ还具有3'→5'核酸外切酶活性,可从游离3'-OH 末端降解双链或单链 DNA,双链 DNA 中3'→5'核酸外切酶活性可被5'→3'聚合酶活性阻断。
切口平移法标记探针的步骤:
(1)模板 DNA 的制备
用限制性内切酶将载体上的外源 DNA 酶切并进行琼脂糖凝胶电泳回收纯化,琼脂糖残留可抑制切口平移反应,因此彻底清除琼脂糖至关重要。也可以用带有外源 DNA 克隆片段的重组载体为模板来切口平移制备探针。
(2)切口平移标记
将模板 DNA 水溶液、DNase Ⅰ、未标记的三磷酸单核苷酸混合物、切口平移标记缓冲液、DNA 聚合酶Ⅰ、32P 标记的核苷酸依次加入反应管,14℃保温20min。
(3)纯化标记探针,测定活性,-20℃保存,1～2周内可用。
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