器官特异性血管遗传靶向技术及应用（一）
5月15日，中国科学院生物化学与细胞生物学研究所周斌研究组在国际学术期刊Circulation Research上发表了题为“Genetic Targeting of Organ-Specific Blood Vessels”的最新研究成果。该项工作建立一套新的遗传操作系统以实现更加精确的遗传靶向，可用于基因敲除和过表达。
南模生物为该研究构建了顺序交叉遗传靶向工具小鼠模型。
到目前为止，遗传靶向工具主要依赖于Cre-LoxP同源重组系统以解决细胞示踪问题，进行基因功能研究。该系统的精度在很大程度上取决于驱动Cre的启动子或基因表达的特异性。也就是指，如果将Cre表达元件插入到A基因中，那么在表达A基因的细胞中可以发挥Cre重组作用。而A基因往往并不能特异性地只在某种特定器官或组织中表达，所以这种传统方法具有固有的局限性。
例如：研究血管常用的遗传工具鼠有VE-cad-Cre、Tie2-Cre等，然而这些工具鼠标记的是所有的内皮细胞，而无法精确地研究特定组织器官的血管。不同器官的血管在结构及功能上是异质性的。不同器官的内皮细胞在损伤反应中的作用都是独特的。因此，如何提高遗传靶向的精度，开发组织特异性Cre工具鼠，对于研究特定细胞类型在某一种器官形成及再生过程中的深入功能研究具有重要意义。
在这项最新的研究中，研究人员精妙地利用Cre-loxP和Dre-rox两套系统，互相排他的重组系统进行顺序交叉遗传靶向操纵，实现精确地遗传靶向器官特异性的血管。
核 心：顺序交叉遗传靶向操纵系统
两个要素：
两种不同的启动子分别来驱动Dre和Cre —— A-Dre 和 B-CrexER（下图B）。
A-Dre：通过 knockin 方式，将 Dre 插入到 A基因座中，使 Dre 的表达与 A基因的表达谱一致。
B-CrexER：通过 knockin 方式，将 CrexER 元件插入到 B基因座中。CrexER是一种新型的诱导型工具鼠——将两个rox位点分别放置于雌激素受体（ER）的两侧，即Cre-rox-ER-rox。
按照这个顺序交叉靶向系统的设计（下图C），一般情况下，Cre-ER融合蛋白停留在细胞质中，无法入核进行Cre-LoxP反应。只有在同时表达A基因和B基因的细胞中，Dre重组酶将识别并切割Rox位点，之后B-Cre从细胞质中释放入核，进行后续的Cre-LoxP重组反应。
利用神经嵴表达的 Nrg1-CrexER 与广泛表达的 CAG-Dre 验证了 CrexER 在经 Dre 切除了 ER-rox 后，Cre-rox融合蛋白仍具有重组酶活性，且特异而有效地在体内发挥Cre重组酶作用。并且 CrexER本身没有漏表达情况的发生。这些数据验证了Dre介导的Cre表达的策略的可行性，并证实了这种新型CrexER可用于进行体内顺序交叉遗传靶向。
图1. Proof-of-principle for a sequential recombination strategy for genetic targeting.
顺序交叉遗传靶向操纵系统是利用两个启动子更加精确地限定了标记的细胞，并且最后的有效输出是Cre重组酶。而两个标记基因A和B的选择对于整个系统是否成功至关重要，需要前期文献与实验中对表达谱有全面的了解。
这项研究中，研究人员就分别在心脏和大脑中各找到了2个Marker基因，成功地实现了在心脏和大脑中特异性标记血管内皮细胞。
应用1：心脏冠状内皮细胞特异性CoEC-Cre
Tie2-Dre：Tie2是泛内皮细胞标志物，在大多数血管以及某些骨髓细胞群中均有表达。通过将Dre敲入到内源Tie2基因的ATG位置，建立Tie2-Dre工具鼠。
Wt1-CrexER：有报道称间皮细胞标志物Wt1在发育中的冠状动脉血管中表达，但不在其他血管中表达。除了心外膜细胞外，Wt1-CreER在胚胎心脏中标记冠状内皮细胞。通过将CrexER插入到Wt1基因的翻译起始密码子（ATG）位置，建立Wt1-CrexER工具鼠。（图2A-B）
验证实验结果显示，Tie2-Dre;Wt1-CrexER确实可以特异且有效地标记冠状血管（图2C-E）。作为内部对照，没有检测到Tie2-Dre;R26-tdTomato组织中的任何tdTomato+细胞，从而排除了Dre-loxP重组。Wt1-CrexER;
T26-tdTomato小鼠中在未给他莫昔芬处理的情况下，也没有检测到任何tdTomato+细胞，说明Wt1-CrexER没有漏表达。
这些数据表明Cre-loxP重组仅在Tie2-Dre和Wt1-CrexER双重组系统中才发生，Tie2-Dre;Wt1-CrexER（以下简称 CoEC-Cre ）可排它性地特异靶向心脏血管。接下来验证双重组系统在基因敲除或过表达中的应用。
图2. Genetic targeting of coronary vessels by Tie2-Dre;Wt1-CrexER line.
