Maurice iCIEF法在疫苗质量控制的应用（二）
Merck疫苗分析和开发部门第一次基于成像毛细管等电聚焦（iCIEF）表征LNPS包装的mRNA的疫苗。他们利用iCIEF，通过对两性电解质以及甘油的添加来优化检测LNP的表观pI。确定好优化条件后，对不同LNP样品的三种独立制剂之间的pI进行重复性检测，结果显示三次样品的峰形保持一致，重现性很好。通过测试了五种浓度的mRNA的LNP样品的pI，使用线性回归分析，将标准品（LNP）的峰面积对mRNA浓度（μg/mL）作图。结果显示，该线性范围的测定系数（R2）为0.997，显示出很强的线性
度，证明了该技术进行定量分析的能力。
配制不同的LNP批次，每个批次包含不同的阳离子脂质与mRNA的比率（摩尔/摩尔）。利用iCIEF对所有制备的LNP的进行表观pI检测，然后将pI值与阳离子脂质和mRNA浓度作对数图。结果显示，LNP表观pI与阳离子脂质浓度有很强的相关性，R2 = 0.956，但与mRNA浓度相关性很弱，R2 = 0.653。揭示了阳离子脂质位于LNP表面，而mRNA位于LNP内部。且LNP充当保护mRNA的保护性疏水屏障。
利用iCIEF检测有无装载mRNA的LNP的表观pI。结果显示，带有和不带有mRNA的LNP在大约7.7处具有相似的pI。但包含mRNA的LNP的峰面积大于不包含mRNA的LNP的峰面积。这可能是散射光和mRNA吸光度组合的原因。
为了证明LNP的表观pI取决于LNP表面的阳离子脂质，用iCIEF检测两种不同pKa的阳离子脂质的LNP的pI。结果显示，LNP的pI分离是基于阳离子脂质pKa值。用iCIEF方法可用于鉴定LNP样品中的阳离子脂质。
用iCIEF方法可以检测热应激时LNP的稳定性。结果显示，随着温度的升高，未装载mRNA（图B）的LNP出现轻微的酸移和尖峰，意味着空的LNP随着温度的升高产生不稳定或者发生聚集。装载mRNA的LNP（图A）随着温度的升高，“酸性变异体”与主峰基线分离得越大。这可能是由于温度的升高，mRNA暴露在LNP表面而造成的。
Development of an imaged capIllary isoelectric focusing method for
characterizing the surface charge of mRNA lipId nanoparticle vaccines, Electrophoresis, 40 (18-19), 2602-2609 Sep 2019.
5.重组乙肝疫苗制剂稳定性研究
Merck疫苗研发中心，利用iCIEF考察重组乙肝疫苗，在3种不同制剂缓冲液及不同冻融次数情况下，等电点变异以及图谱稳定性。从而判断疫苗制剂缓冲液的稳定性。结果显示，利用iCIEF观察到，从制剂缓冲液A到C这三种制剂中的pI值2.7均没有变化。但在1x~5x冻融循环后，在制剂缓冲液B和C中观察到了spikes峰，但在制剂缓冲液A的峰型仍然很稳定。因此，与配方缓冲液B或C相比，配方缓冲液A为HBsAg提供了最稳定的缓冲体系。
Development of Imaged CapIllary Isoelectric Focusing (iCIEF) method and
Use of CapIllary Zone Electrophoresis (CZE) in Hepatitis B Vaccine
(RECOMBIVAX HB®). Electrophoresis, 35 (7), 1072-8 Apr 2014.
6.结合疫苗载体蛋白的验证、工艺评价、稳定性研究
对CRM197蛋白的验证除了可以通过将pI值和电泳图谱与参考标准谱图相匹配，此外，可以通过结合靶向CRM197的mAb来阐明该CRM197蛋白的特异性。
Merck疫苗分析开发研究实验室，利用iCIEF观察，在用其特异性抗CRM197
mAb滴定CRM197时，电泳图谱发生的变化。结果显示，电泳图谱以约1：1的摩尔比时停止变化。另外，此CRM197的酸性峰也与其主峰一起移动，表明这些酸性形式在与其抗CRM197
mAb结合方面也具有活性。
利用iCIEF评价CRM197的上游和下游工艺。结果显示，上游样品S1和S2的浓度测量结果的RSD<15％，样品S3和S4的RSD<5％。体现了iCIEF方法的高分辨率，以及可以用于快速筛选最高的细胞克隆生产者和最佳的发酵条件，以提供最大的CRM197效价。
利用iCIEF监视贮存过程中蛋白的电荷异质性，作为产品稳定性评估的一部分。结果显示，在3个月的存储期间（22℃），CRM197的酸性峰（pI 5.77和5.82）增加，而主峰（pI 5.9）降低。
利用iCIEF观察CRM197在四个不同温度下三个月的稳定性曲线。在22℃（红线）下，酸性峰面积增加，主峰面积减少；在4℃（蓝线）下，酸性峰面积增加慢得多，表明在此温度下三个月内略有降解。在-20℃（绿线，）和-70℃（黑线）的酸性峰没有变化，表明此CRM197在这两个温度下非常稳定。
Use of imaged capIllary isoelectric focusing technique in development of diphtheria toxin mutant CRM197, Electrophoresis,35 (7), 1065-71 Apr 2014.
Merck生物制剂和疫苗研究实验室，利用iCIEF的280nm紫外吸收和荧光模式，检测不同发酵条件下，疫苗常用载体蛋白CRM197的pI差异。结果显示，在吸收光模式下，S1和S4没有从其它杂质中分离出来。但是在荧光模式下，所有四个样品中均清楚地观察到CRM197，体现了iCIEF荧光模式下更高的灵敏度和选择性。
Quantitation of CRM197 using imaged capIllary isoelectric focusing with fluorescence detection and capIllary Western, Anal Biochem, 534, 19-23 2017 Oct 1.
