利用 TSQ Quantiva 定量肉类掺假比例（一）
引言
“挂羊头，卖狗肉”是日常用的一个熟语。虽然随着时间的发展，这句话已经难以反应最真实的情况，在世界上大部分地方，狗已经不作为食用肉的来源，即使在极少数食狗肉的地方，狗肉的价格也往往比羊肉还高，已经失去了造假的意义。但是，这种商品标识与实际商品的组成不一致的情况，却是长期存在的。自从 2013 年欧盟“马肉风波”之后，中国肉类掺假的现象也屡见报道，进一步加深了人们对肉类真实性的担忧。这种非标明的添加，极大的扰乱的市场次序，影响相关宗教人士、特殊风俗与部分肉类禁食人士的情感与健康，也带来了潜在致病性和疾病控制的难题。目前最常用检测的方法有：基于核酸的聚合酶链式反应技术（PCR），和基于抗体抗原结合的酶联免疫法（ELISA）。前者受到 DNA 降解，复杂基质的干扰和样品提取与扩增方法的影响，干扰了定性和定量的准确性。后者往往受制于抗体的制备，加工过程中蛋白变性，复杂基质和近亲缘种属之间同源干扰导致的假阳性的影响 [1, 2]。
随着生物质谱技术的成熟，大规模的定性和定量研究蛋白表达谱的技术已经很成熟。因此，利用质谱技术寻找不同肉类样品特征性蛋白或者多肽，并进行定量，能够避免现在最常用的 PCR 技术和 ELISA 所面临的上面的种种问题，其优点包括：不受食品加工的过程影响，因为氨基酸序列比核酸序列在加工过程中更容易保存；同时实现定性与定量，避免假阳性且定量结果更加准确可靠；能够同时监测多种添假 [2]。
猪肉，禽肉，牛肉和羊肉是世界上消耗量最大的四种肉类 [3]。大多数情况下，羊肉最贵，可能比最便宜的禽肉贵到 5 倍以上，在实际生活中，对不法商人具有最大的掺假诱惑力。我们基于超高分辨的 Q Exactive 质谱平台，研究了五种常见肉类彼此之间的特征性专属多肽。选取其中找到的部分多肽，通过人为的将几种不同的肉类进行混合研究，模拟现实中掺假的情况，用 TSQ Qμantiva 建立了基于 SRM（Selected Reaction Monitoring）的掺假比例定量方法。整个实验流程如下（图 1）：
图 1. 基于 Thermo 质谱平台肉类真实性解决方案。（A：样品裂解； B：肉类裂解样品还原烷化酶切；C：高分辨质谱平台采集每个物种数据；D：Proteome Discoverer 2.0，SEIVE 2.0 软件寻找物种特征性多肽，Pinpoint 软件批量自动生成定量离子对；E：TSQ Quantiva 定量分析）
实验方法：
1.材料与样品制备
本实验所用肉类样品牛肉，猪肉，鸡肉和鸭肉购自于上海某大型超市，羊肉购自于上海某羊肉专卖店。五种肉类样品分别去皮与脂肪取纯肌肉样品约 100 mg，用 RIPA 裂解液裂解后丙酮沉淀，尿素溶解后取部分测浓度，剩余样品还原烷化，酶切过夜，固相萃取除盐，离心浓缩后用 0.1%FA 溶解后备用。
2.掺假实验
将鸡与鸭的裂解液等比例混合，取羊 1 μg 总蛋白酶切产物六份，分别添加鸡和鸭的裂解酶切产物 1 μg、100 ng、10 ng、5 ng、1 ng、0.1 ng，模拟不同比例的掺假样品，每份样品进样三次。
3.色谱条件
液相 RSLC U3000 ，流速 0.2 mL/min，流动相 A 相为 0.1% FA/H2O，流动相 B 相为 0.1% FA/ACN。色谱柱 Accucore-150-C18，100mm*2.1mm。梯度条件为：
表 1. 色谱梯度
Time (min) | A相（%） | B相（%） |
0 | 100 | 0 |
0.2 | 90 | 10 |
16 | 60 | 40 |
17 | 20 | 80 |
17.5 | 20 | 80 |
18.5 | 100 | 0 |
20 | 100 | 0 |
4.质谱采集方法
质谱离子源参数设置为：喷雾电压 3500 V，鞘气 38 Arb，辅气 15 Arb，反吹气为 0 Arb，离子传输管温度 275℃，离子源雾化温度为 380℃。质谱采集参数为：采集周期为 0.3 s， 碰撞气为 1.5mTorr， Q1 和 Q3 分辨率都为 0.7，源内裂解能量为 0。
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