circRNA机制研究汇总（一）
文章导读
超强子调控circRNA-Nfix缺失诱导成年小鼠心肌梗死后再生
circRNAs正在成为心脏发育和疾病强有力的调节因子，但其在心脏再生中的作用仍然未知。鉴于此，作者与他的团队探究了与超增强子(SEs)相关的circRNA-Nfix在小鼠心肌梗死后再生过程中的功能，并探究了其调节心脏重塑的分子机制，并于2019年4月5日，将该成果发表在了circulation杂志（IF=18.88）中。在本研究中，作者首先利用生物信息学分析RNA测序数据并结合SE目录，识别与SE相关的circRNAs，并利用qPCR和原位杂交技术检测发现发现circNfix在人类、大鼠和小鼠的成年心脏中过表达。然后通过在心肌梗死(MI)后心肌细胞(CM)中干扰或过表达circNfix，探究其对细胞增殖和心肌修复过程中的作用，并发现下调circNfix能够促进心肌梗死后CM增殖和血管生成，并抑制CM凋亡，减轻心功能障碍，改善预后效果。最后作者利用染色质免疫沉淀法(ChIP)和电泳迁移率转移法(EMSAs)方法测定转录因子Meis1与能够与circ-nfix的SE结合；利用RNA pull-down和荧光素酶报告基因分析方法研究circRNA与蛋白质或与miRNA的相互作用；发现下调circNfix能够增强Ybx1与Nedd4l (E3泛素连接酶)的相互作用，并诱导Ybx1发生泛素化降解，抑制下游cyclin-A2和cyclin-B1的表达。此外, circNfix还作为ceRNA，吸附mir-214并促进Gsk3β表达和抑制β-catenin活性。即：SE调控的circNfix缺失通过抑制Ybx1泛素依赖降解，增加miR-214活性，促进心肌梗死后心脏再生修复和功能恢复，可能是改善心肌梗死预后的一个有前景的策略。
技术路线
1 筛选并识别CircNfix
CircNfix是一种保守的心脏circrna。CircRNA的RPM表达水平（A）。CircNfi和circSlc8a1分别在P7小鼠和大鼠心肌细胞(CMs)和成纤维细胞(CFs)中的表达（B）。C-F.鉴定为环状RNA。qPCR检测 在鼠各种组织（G）、鼠心脏原代分析的各种细胞（H）、不同时间段的小鼠心脏组织（I）、不同时间段的小鼠心脏组织分离的心肌细胞（J）。ISH（K）和相应的分析（L-M）检测CircNfix在人、大鼠、小鼠心脏的表达。核质分离PCR（N）和FISH（O）检测CircNfix的亚细胞定位。
2 探究CircNfix的功能
（1）CircNfix下调促进了CM的增殖：Ki67免疫荧光（A）、EdU染色（B）、PH3免疫荧光（C）和Aurora B免疫荧光（D）检测干扰CircNf对P7 CM的增殖能力的影响。荧光线粒体染料四甲基罗丹明乙酯(TMRE)检测干扰CircNf对CM的分裂能力的影响（E）。Ki67免疫荧光（F）、EdU染色（G）和PH3免疫荧光（H）检测过表达CircNf对P0 CM的增殖能力的影响。对Nkx2.5、α-SMA、RUNX1、DAB2进行免疫荧光染色检测P7 CM去分化能力（I）。流式细胞术分析干扰CircNf对CM的细胞周期的影响（J）。
（2）circNfix下调可诱导心肌梗死后心脏再生：心肌梗死前、梗死后1、14、28天超声心动图分析心功能（A）。射血分数的定量分析(EF)及缩短分数(FS)（B-C）。小鼠体内转染sh-circnfixo28天后的小鼠心脏得分（D）。心肌梗死后14、28天小鼠心室横切面TTC染色（E）。心肌梗死后14天和28天Masson染色的心脏切片代表性图像（F）。心脏切片中纤维化区域的定量分析（G）。心肌梗死后shcircNfix组Kaplan-Meier生存曲线分析（H）。
3 探究CircNfix的分子机制
转录因子：
（1）转录因子Meis1通过结合Nfix位点的SE驱动circNfix表达：H3k27ac、H3k4me1和H3k27me3在人心脏组织Nfix位点的ChIP-seq谱（云序生物提供该服务）（A）。H3k27ac、H3k4me1、H3k27me3、P300、DNA超敏(DHS)、Meis1及PhastCons在小鼠心脏组织Nfix位点的保守性评分，以及小鼠CMs中H3k27ac ChIP-seq（云序生物提供该服务）（B）。SE与circNfix启动子区looping事件的3C-qPCR分析（C）。四种成分增强子(E1、E2、E3、E4)构建的pgl3启动子报告载体荧光素酶检测（D）。Meis1沉默后P7
CMs中野生型E2和突变E2的荧光素酶活性（E）。circNfix-SE中孵育Meis1结合位点被DIG-ddUTP标记寡核苷酸探针后，P7
CMs中提取的核蛋白的EMSA结果（F）。ChIP-qPCR（云序生物提供该服务）检测显示Meis1结合位点在circNfix-SE中扩增（G）。QRT-PCR检测Meis1基因敲除后P7
CMs中circNfix和Nfix mRNA的表达水平（H）。RNA FISH 检测Meis1基因敲除后P7
CMs中circNfix的亚细胞定位（I）。EdU染色检测Meis1和circNfix干扰后对P7 CMs增殖的影响（J）。
