一种利用表面等离子共振定量流感病毒的新方法...（一）
一种利用表面等离子共振定量流感病毒的新方法—单向放射免疫扩散法
一种利用表面等离子共振定量流感病毒的新方法——单向放射免疫扩散法
译自= A novel assay for lnfluenza virus quantification using surfece plasman resanance. Vaccine 2010 Jan8:28(3)759-65
C. Estmer Nilsson 1, S.Abbas1, M.Bennem 1,
A.Lorssan 2, M.D. Hamalalnen 2, A. Frostell Karlssan 2
1 GE Heathcare BioScience AB, Bjorkgatan 30, SE-751 84 Uppsata,Sweden
2 GE Heathcare BioScience AB. Rapsgatan 23. SE-751 84 Uppsata Sweden
利用单向放射免疫扩散法(SRID)来定量血细胞凝集素(HA)，是确保季节性流感疫苗的产品效力的主要方法。本文介绍了一种利用生物传感器技术定量流感病毒的新方法。此方法通过将HlNl、H3N2和B型病毒的HA蛋白固定在传感器芯片上，以抑制性分析的形式来定量病毒。初步结粟显示这种分析与SEID相比，具有具有更高的灵敏度(检测范围0.5—10 ug/ml)和更高的精确度，并且能显著降低了分析及手工操作时间。
简介
流感病毒疫苗的接种是降低季节性流感死亡率的基本策略。在开发和生产过程中流感疫苗的抗原含量主要是利用免疫化学法定量血细胞凝集素(HA)来确定的。单向放射免疫扩散法(SRID)其中最常用也是最重要的方法。自1978年以来，美国食品药品监督管理局(FDA)批准的所有人灭活流感病毒疫苗的效力加的效力都是用SRID来确定的。同时，它还是世界卫生组织(WHO)和欧洲药品管理局(EMEA)的推荐方法[1-3]。然而，除了非常耗费劳力，这种方法还有一些其它缺陷，如准确性低、精确度和灵敏度也低[4]。
到目前为止，流感疫苗主要是利用鸡胚来生产的。然而，对流感病毒新近爆发的恐慌让人们着手利用细胞门着手利用细胞培养来更有效地生产疫苗。这种工艺开发急需新的灵敏而简单的分析工具。
目前已有多种不同的针对流感病毒的定量和检测方法见诸报道：酶联免疫吸附分析(ELISA)[5-7]。神经氨酸酶(NA)活性分析[8,9]，HPLC法[10-12]，血凝分析[11,13]，以及定
量PCR(qPCR)[14-16]。其中一些方法与SRID相比，灵敏度有所提高。然而，除了多重定PCR，这些方法都不能减少手工操作时间，也不能在单个实验中同时定量三种不同亚型的HA。然而，鉴于qPCR必须经过将RNA转化成DNA的反转录步骤，因而相比起定量qPCR更适合用于流感病毒及分型上。Williams等[17]展示了一种液相色谱串联质谱技术联合同位素稀释，用于病毒蛋白的绝对定量。此方法的优势在子能在一个实验中分析三价疫苗，而且降低了对参照抗原和血清的需求量。然而，由于确定HA浓度的独立参考标准无法得到，也就无法与SRID测定进行直撞的比较。此外，这个方法还需要在分析前制备样品[17]。
过去也有利用表面等离子共振(SPR)来检测并定量流感病毒的报道，这些全是基于直接的结合方法[18-25]。这些研究要么测定HA与它的唾液酸受体结合的动力学[20,22]，要么测定抗体与HA和NA的亲和力[18,19,21]。或者描述HA的RNA适体（aptamer）筛选[23]。其中一篇报道介绍了在处理样品和疫苗中定量流感病毒的方法[25]。这种方法利用唾液酸型化台物作为多种病毒株通用的弱亲和力配体，分析范围在10-100 ug/ml。它利用了持续的弱亲和力生物传感方法来避免了再生的需要，并减少了分析时间[25]。小型化的生物传感器也经过
禽流感病毒检测的测试，特定抗原的检测极限在5 ug/ml[26]。尽管这些基于SPR的方法缩短了手工操作时间，但它们并不比SRID更灵敏，也无法同时分析三种病毒株。
在此我们介绍一种新方法，利用表面等离子共振以抑制分析的形式准确定量流感病毒。重组的HA蛋白[27](分别为A/H1N1,A/H3N2和B)固定在传感器芯片的葡聚糖基质上，随后让病毒抗原和血滴混合液中针对三种流感类型特异的游离抗体与表面的HA蛋白结合，产生响应的变化(图1)。样品中病毒浓度越高，残余抗体结合响应就越低。重组HA蛋白固定在同一块芯片表面的三个不同流动槽内，这样就能在同一实验中分析三价疫苗。研究表明生物传感器分析是可靠的．与SRID相比回收率、精确度和灵敏度更高，而分析时间更短。校准曲线范田是0.5-10 ug/ml,所有三种亚型(A/H3N2、AHlNl和B)的检测极限预计低子0.5 ug/ml。由于此方法中的参照抗原和血清与当前疫苗效力检测方法中所使用的相同。这种新方法有可能取代或者补充SRID，成为未来的流感疫苗的定量方法。
-
投融资
-
产品技术
-
科技前沿
-
项目成果
-
焦点事件
