采用快速循环荧光定量PCR仪和LightScanner32上的非标记探...
采用快速循环荧光定量PCR仪和LightScanner32上的非标记探针进行MAAB
简介
高分辨率熔解曲线可以通过扫描PCR的扩增片断来检测杂合体中基因序列的变化。配合使用高分辨的饱和荧光染料，在检测小于400bp的PCR片断的SNP、插入或缺失时的灵敏度可达98%以上。该方法自开发以来，被不断的应用于新的领域，如采用小片段扩增法和非标记探针法（LunaProbes）对已知序列进行基因分型。非标记探针的3’
端被封闭，以防止PCR过程中的扩增，采用双链DNA的饱和染料LCGreen
Plus和非标记探针（LunaProbes）熔解温度的不同（Tm值）来区分不同的基因型。非标记探针可用于基因分型中等位基因的定量，可以检测出突变率≦10%的等位基因的突变。
最近，一种基于快速循环荧光定量PCR仪和LightScanner32上的非标记探针的高分辨率熔解曲线分析，进行突变体等位基因的偏向性扩增（MAAB）的方法被开发的了出来，该方法可以增加非标记探针在检测等位基因突变中的灵敏度。
Mutant Allele Amplification Bias（MAAB）原理
非标记探针的3’ 端被封闭，以防止PCR过程中的扩增。探针的设计和野生型等位基因完全互补，和突变的等位基因位点不完全互补。突变的等位基因的偏向性扩增主要是通过设定PCR反应的退火温度来实现的。PCR的退火温度要低于野生型等位基因探针的退火温度而高于突变体等位基因的退火温度，介于完全互补的探针（野生型位点）Tm值和非完全互补的探针（突变体的位点）Tm值之间。在该退火温度下，完全互补的探针和目标DNA链仍然结合在一起（Figure1a），因而抑制野生型序列的PCR反应（Figure1b），从而实现突变体等位基因的偏向性扩增。
方法
用非标记探针在野生型等位基因的背景下检测突变率≦1%的等位基因的突变，使用了不同的退火温度和不同的核酸外切酶。选用3个不同的基因用于检测：TP53（exon 8）与癌症相关的突变，PAH（exon 11）与PKU（苯丙酮尿症）相关的突变，还有一个与疟疾相关基因的对药物疗法具有抗性的突变，然后使用普通的热启动PCR仪做温度梯度PCR，来确定非标记探针的Tm值和普通的热启动PCR仪是否可以完成MAAB。
结果
核酸外切酶postive（NEB和Roche FastStart）没有出现MAAB（65-75℃）（图2）。
使用非标记探针在没有MAAB时对每一个目的基因检测突变的等位基因的灵敏度在5-10%(图3)。
使用热启动PCR仪做温度梯度时，TP53 x8和PAH x11有MAAB（图4左）。但是疟疾相关基因在热启动的定量PCR仪器上没有表现出突变的等位基因的加强（图4右）。
之后采用快速循环荧光定量PCR仪和LightScanner32上的非标记探针的高分辨率熔解曲线，采用温度梯度进行突变体等位基因的偏向性扩增。与使用普通的热启动PCR仪相比，使用快速定量PCR仪，退火温度56℃时对MAAB有明显的影响。将纯合的WT和突变的等位基因混合（50/50），证实了对突变的等位基因的检出率可以在1%以下（图5）。
图 5.
LunaProbes的标准化差异峰. 野生型的等位基因位点（灰色）= 62ºC，突变型的等位基因位点（红色）=
54ºC。58ºC作为退火温度来进行50–50的混合样品（黄色）的突变等位基因的差异性扩增。这种扩增方法使得差异扩增的分辨率达到10倍，并且使得检测的灵敏性到0.7–1.5%
这一结果证实了使用非标记探针的MAAB比没有MAAB的检测的灵敏度要高。
结论
以下是使用非标记探针进行MAAB的重要参数：
1.温度转换率和PCR目的片度的温度
2.退火温度和探针的Tm值
3.核酸外切酶
注意这几个重要的参数后，本研究中对突变的等位基因的检测率可以达到1%，应用这种方法检测已知的体细胞突变（p53，EGFR, BRAF），提早发现寄生虫感染避免药物治疗不当，高灵敏度检测胎儿DNA突变。在LS32上进行定量PCR及高分辨溶解曲线分析，结合使用使用快速定量PCR方法和非标记探针对于MAAB至关重要。
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