PCR抑制物怎么除
由于粪便中含有大量Taq 聚合酶的抑制物质, 很多方法提取的DNA 其扩增效果不佳, 如H?0?8ss 在PCR 反应中就加了牛血清蛋白来克服抑制剂对Taq 聚合酶的抑制作用。目前采取的方法有多种, 作者将其大致分两类:
( 1 ) 粪便裂解后纯化DNA , 如Ernest et al .(2000) 在粪便经蛋白酶K处理后, 用酚- 氯仿多次抽提, 然后, DNA 溶液经聚丙烯酰胺葡聚糖柱子洗脱来纯化DNA ; Taberlet et al . (1996) 、Reedet al . (1997) 和Parsons et al . (1999) 用硫氰酸胍处理粪便, 直接用硅粒沉淀DNA 而使之与杂质分离达到纯化的目的; Constable et al . (1995) 和Savill et al . (2001) 在用蛋白酶K 裂解粪便的同时另外加入了十六烷基三甲基溴化铵( Cetylt rimethyl2ammoniumbromide , CTAB) 消化PCR 反应抑制物, 再经多次酚- 氯仿抽提纯化DNA ; Ding et al . (1998) 将DNA 抽提试剂盒
(XTRAXTM DNA Ext raction Kit , BIODESIGN International) 应用于大熊猫的粪便DNA 提取, Tengel et al . (2001) 介绍了提取粪便DNA 的试剂盒QIAamp DNA Stool Mini Kit , Germany) 清除PCR 抑制物; Reed et al . (1997) 将碱性多价金属离子螯合树脂Chelex2100 应用于清除抑制物(Reed 在自己的文章中已证明该方法并非理想) 。这些方法或操作繁琐, 花费高, 或结果不十分理想, 或缺乏实验室通用性。
(2) 粪便预处理, 如Deuter et al . (1995) 先将粪便于- 80 ℃冷冻, 再匀浆, 经两次差速离心除去了残渣, 但经过柱洗脱才得到了纯度高的DNA ; Lantz et al . (1997) 利用聚乙二醇和葡聚糖40 组成的二相系统对粪便进行预处理, 很理想地除去了PCR 抑制物, 但花费较高, 缺乏通用性; Machiels et al . (2000) 用磷酸缓冲盐溶液和酚- 氯仿- 异戊醇组成的二相系统对粪便预处理, 但其后的处理过程十分繁琐。
介绍一种在细胞裂解前经丙酮预处理的抽提方法。丙酮是一种优良的有机溶剂, 在DNA 的提取过程中曾被用来消除抑制物, 有很好的效果(Schneiderbauer et al . , 1991 ; Udy et al . , 1994 ;施苏华等, 1996 ; Purohit et al . , 2003) 。本实验
预处理中丙酮能很好地将粪便中的色素、多糖及一些有机盐等PCR 抑制物除去, 最后得到的DNA 可用于PCR 扩增, 并用于进一步的遗传分析。
一种从大熊猫粪便中提取DNA 的改进方法钟 华① 赖旭龙② 魏荣平③ 刘中来①33
( ①华中师范大学生命科学学院, 武汉430079)
( ②中国地质大学地球科学学院, 武汉430074) ( ③中国保护大熊猫研究中心, 四川卧龙623006)
。在粪便DNA的提取过程中采用一个新的预处理方法, 将粪便用预冷的丙酮洗2～3 次, 除去粪便中含有的大量PCR 抑制物,然后用蛋白酶K裂解、酚- 氯仿抽提, 能提取到纯度很高的DNA 供PCR 扩增。
粪便DNA小量提取试剂盒
动物粪便样品中存在大量有意义的基因组DNA，其DNA主要来自于动物自身脱落的消化道细胞、消化道中各种细菌(如大肠杆菌)或真菌等微生物,以及一些末消化食物DNA。由于粪便中存在大量抑制因子，所以常规的DNA纯化方式并不能有效地去除这些杂质，而导致下游实验的失败，如PCR不能扩增出所需片段。Omega Biotek
公司采用了硅胶柱纯化方式和独特的溶液系统,能有效去除动物粪便中各种影响下游实验（如PCR）的抑制因子，并能高效地回收粪便中的基因组DNA。
动物粪便样品经PBS和ST1重悬后，70°C处理5分钟裂解细菌；离心去除不溶解的杂质，加入ST2和蛋白酶消化样品；氯仿抽提去除蛋白质，转移上清液加入异丙醇沉淀DNA，进一步去除各种杂质；加入灭菌水溶解DNA，调节结合条件，上柱离心吸附DNA；经过两次快速洗涤，去除残留的杂质和抑制物，最后DNA溶解于灭菌水或低盐缓冲液中。纯化的DNA可直接用于PCR,Southern杂交，定量PCR等各种灵敏实验。
