BIOXL 猪口蹄疫亚O型一步法荧光RT-PCR诊断试剂盒说明书
包括48 个扩增反应所需的试剂
请在使用前通读操作说明书
1. 试剂盒组成
￭ 25 管 扩增反应试剂球 (Reagent Sphere; 4oC 保存)
￭ 2 x 520 μl FMDVA-1 扩增反应试剂球溶液 (Sphere Diluent; -20oC 保存)
￭ 2 x 25 μl 阳性对照 (Positive control; -20oC 保存)
￭ 1 x 10μl Taq酶(Taq Polymerase; -20oC 保存)
保存条件
试剂球需置干燥剂中保存在4oC，已融解的试剂球则需保存在零下20oC。其他试剂需保存在零下20oC。使用前在冰上溶解各试剂并充分混合，不要旋涡振荡含酶的扩增反应试剂。
2. 操作程序
扩增反应试剂的准备
1. 计算所需的反应数量 (n)
2. 需要溶解的试剂球 = 0.5 x n
3. 每个试剂球需要 40 μl 试剂球溶液及0.4μl Taq酶。
4. 在冰上溶解试剂，并轻轻扣击充分混合 (不要旋涡振荡含酶的试剂)
反应的准备
1. 实验中除从样本中获得的RNA 模板外，我们还建议设置阳性和阴性（水）对照
2. 按照下表准备扩增反应试剂：
反应组分 | 每个反应体积 |
扩增反应试剂 | 20 μl |
样品RNA | 5 μl |
总体积 | 25 μl |
注意:
￭ 实验时 RNA 应放在冰上
￭ 阳性对照建议加5 μl 试剂盒提供的阳性对照。
￭ 建议PCR 过程中检测样本设置重复，以便得到可靠的实验结果
￭ 为了验证阴性实验结果不是由于样本中存有PCR 抑制物而导致PCR 呈阴性反应，我们建议在测试样本中加1 μl 的阳性对照作为spiking 对照 (spiking control)，同时进行PCR 反应。
PCR 循环:
数据收集位点（FAM染料） ABI7700 ABI7300 其它仪器 |
1 个循环 42oC 30 分钟 * |
95oC 10 分钟 * |
5 个循环 95oC 10 秒 * |
45oC 30 秒 * |
72oC 60 秒 * |
40 个循环 95oC 15 秒 * |
58oC 60 秒 * * * |
( * 表示位点收集FAM读数)
3. 实验数据分析
阴性的实验结果有几个可能性：
1. 样本中不存在目的片段；
2. 样本中目的片段的量低于检测值；
3. 样本中存有 PCR 抑制物。
试剂盒中设计spiking 对照 (spiking control) 是为了确定没有发生PCR 抑制。
如果样本中加了阳性对照以后扩增结果的Ct值接近40（或者接近阴性对照的Ct值），说明样本中存在PCR 抑制物，那幺此次阴性的实验结果就不能作为正确的结果，需要重新开始样本核酸的提取和PCR 扩增。
