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常见的PCR反应抑制物一览

2021.6.23

一个PCR反应过程分为很多的步骤,同时也受到很多因素的影响,可以分为内部因素和外部因素,内部因素是指正常试剂体系中的成分,外部因素是指环境或者样本带入的因素。


体系内部因素


引物:引物是整个PCR体系最重要的部分,也是决定一个PCR反应特异性的关键,引物在设计时要遵守一定的原则(长度、扩增跨度、碱基等)。
酶及其浓度:目前有两种Taq DNA聚合酶,一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶,另一种为大肠杆菌合成的基因工程酶,酶浓度过高可引起非特异性扩增,浓度过低则合成产物量减少。
dNTP的质量与浓度:dNTP溶液呈酸性,一般配置成体系需将其调节至7.0-7.5,正常情况下4种dNTP的浓度应该相等,如果其中某一种过高就会引起错配,浓度过低又会引起PCR产物的产量。
模板核酸(靶标):模板核酸的量和纯化程度,是PCR成败与否的关键环节之一,对于RNA模板更要注意RNA的降解。
Mg2+浓度:主要影响PCR扩增的特异性和产量,一般要对应dNTP的浓度。Mg2+浓度过高,反应特异性降低,出现非特异性扩增,浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性,使反应产物减少。
温度与时间的设置:PCR原理三步骤涉及变性-退火-延伸三个温度点,也就是变性温度与时间、退火(复性)温度与时间、延伸温度与时间。
循环次数:循环次数决定PCR扩增程度,PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。一般温度循环次数在30-40次之间,循环次数越多,非特异性产物的量就越多。


体系外部因素


  • SDS:离子去污剂,0.01%即可完全抑制PCR反应,0.005%可显著降低产量

  • 苯酚:0.5%即可完全抑制PCR反应,0.2%可显著降低产量

  • 乙醇:大于1%的浓度可抑制PCR反应,但在某些体系里又能增加产量

  • 异丙醇:抑制作用比乙醇稍强

  • 乙酸钠:大于5mM时抑制PCR反应

  • 氯化钠:大于25mM时抑制PCR反应(生理盐水无影响)

  • EDTA:0.5mM可使PCR产物减少,1mM完全没有PCR产物

  • 血红素(heme)-来源:血液,大于1mg/ml抑制PCR反应

  • 氯高铁血红素(hemin):大于0.1ng/μl抑制PCR反应

  • 丹宁酸(tannic acids):大于0.1ng/μl抑制PCR反应

  • 肝素:大于0.15IU/ml抑制PCR反应

  • 尿素-来源:尿,大于20mM时产生抑制

  • 腐殖质-来源:土壤,植物材料,自然界水

  • 植物多糖-来源:粪便,植物多糖

  • 聚苯乙烯,聚丙烯-来源:紫外线照射塑料管

  • 胆酸盐-来源:粪便

  • 胶原质-来源:组织

  • 靛青染料-来源:粗斜纹棉布,牛仔裤

  • 蛋白酶-来源:牛奶

  • 钙离子-来源:牛奶,骨头

  • 铁离子-来源:血液

  • 二甲苯胺

  • 溴酚兰

  • 胆红素(bilirubin)

  • 其他抑制剂


除上述抑制剂外,还存在一定的PCR增强剂,比如甜菜碱、二甲基亚砜、甲酰胺、甘油、PEG、亚精胺和单链DNA结合蛋白等,但是在高浓度情况下,也会对PCR产生抑制,因此如何采用增强剂消除抑制剂的影响,采用多少的浓度对结果都存在很大的影响。


临床PCR常见问题


1

假阳性问题

方法学问题:靶基因序列特异性、引物错配、非特异性扩增污染问题:样本污染、产物污染、产物污染解决办法:严格区分试验区域及人员培训,使用UNG技术


2

假阴性问题

问题来源:试剂因素、操作因素、仪器因素、标本因素解决办法:设置阳性对照监测试剂问题降低操作难度,提高操作人员水平室内质控、室间质控监控使用抗干扰能力强的试剂提取样本




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