分子生物学常用实验技术（五）
第四章RNA 的提取和cDNA 合成
第一节概述
从真核生物的组织或细胞中提取mRNA,通过酶促反应逆转录合成cDNA
的第一链和第二链,将双链cDNA 和载体连接,然后转化扩增, 即可获得cDNA 文库,构建的cDNA
文库可用于真核生物基因的结构、表达和调控的分析;比较cDNA 和相应基因组DNA
序列差异可确定内含子存在和了解转录后加工等一系列问题。总之cDNA 的合成和克隆已成为当今真核分子生物学的基本手段。自70 年代中叶首例cDNA
克隆问世以来,已发展了许多种提高cDNA 合成效率的方法,并大大改进了载体系统，目前cDNA 合成试剂已商品化。cDNA
合成及克隆的基本步骤包括用反转录酶合成cDNA 第一链,聚合酶合成cDNA 第二链,加入合成接头以及将双链DNA
克隆到于适当载体(噬菌体或质粒)。
一、RNA 制备
模板mRNA 的质量直接影响到cDNA
合成的效率。由于mRNA 分子的结构特点,容易受RNA 酶的攻击反应而降解,加上RNA 酶极为稳定且广泛存在,因而在提取过程中要严格防止RNA
酶的污染,并设法抑制其活性,这是本实验成败的关键。所有的组织中均存在RNA
酶,人的皮肤、手指、试剂、容器等均可能被污染，因此全部实验过程中均需戴手套操作并经常更换（使用一次性手套）。所用的玻璃器皿需置于干燥烘箱中200℃烘烤2
小时以上。凡是不能用高温烘烤的材料如塑料容器等皆可用0.1%的焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶液处理,再用蒸馏水冲净。DEPC 是RNA
酶的化学修饰剂,它和RNA 酶的活性基团组氨酸的咪唑环反应而抑制酶活性。DEPC 与氨水溶液混合会产生致癌物,因而使用时需小心。
试验所用试剂也可用DEPC
处理,加入DEPC 至0.1%浓度,然后剧烈振荡10 分钟,再煮沸15 分钟或高压灭菌以消除残存的DEPC,否则DEPC
也能和腺嘌呤作用而破坏mRNA 活性。但DEPC 能与胺和巯基反应,因而含Tris 和DTT 的试剂不能用DEPC 处理。Tris
溶液可用DEPC 处理的水配制然后高压灭菌。配制的溶液如不能高压灭菌,可用DEPC 处理水配制,并尽可能用未曾开封的试剂。除DEPC
外,也可用异硫氰酸胍、钒氧核苷酸复合物、RNA 酶抑制蛋白等。此外,为了避免mRNA 或cDNA
吸附在玻璃或塑料器皿管壁上,所有器皿一律需经硅烷化处理。
细胞内总RNA 制备方法很多,如异硫氰酸胍热苯酚法等。许多公司有现成的总RNA
提取试剂盒,可快速有效地提取到高质量的总RNA。分离的总RNA 可利用mRNA 3'末端含有多聚(A)+ 的特点,当RNA 流经oligo
(dT)纤维素柱时,在高盐缓冲液作用下,mRNA
被特异的吸附在oligo(dT)纤维素上,然后逐渐降低盐浓度洗脱,在低盐溶液或蒸馏水中,mRNA
被洗下。经过两次oligo(dT)纤维素柱,可得到较纯的mRNA。纯化的mRNA 在70%乙醇中-70℃可保存一年以上。
二、cDNA 第一链的合成
所有合成cDNA
第一链的方法都要用依赖于RNA 的DNA
聚合酶(反转录酶)来催化反应。目前商品化反转录酶有从禽类成髓细胞瘤病毒纯化到的禽类成髓细胞病毒(AMV)逆转录酶和从表达克隆化的Moloney
鼠白血病病毒反转录酶基因的大肠杆菌中分离到的鼠白血病病毒(MLV)反转录酶。AMV
反转录酶包括两个具有若干种酶活性的多肽亚基,这些活性包括依赖于RNA 的DNA 合成,依赖于DNA 的DNA 合成以及对DNA:RNA
杂交体的RNA 部分进行内切降解(RNA 酶H 活性)。MLV 反转录酶只有单个多肽亚基,兼备依赖于RNA 和依赖于DNA 的DNA
合成活性,但降解RNA NA 杂交体中的RNA 的能力较弱,且对热的稳定性较AMV 反转录酶差。MLV
反转录酶能合成较长的cDNA(如大于2-3kb)。AMV反转录酶和MLV 反转录酶利用RNA 模板合成cDNA 时的最适pH
值,最适盐浓度和最适温室各不相同,所以合成第一链时相应调整条件是非常重要。AMV 反转录酶和MLV 反转录酶都必须有引物来起始DNA
的合成。cDNA 合成最常用的引物是与真核细胞mRNA 分子3'端poly(A)结合的12-18 核苷酸长的oligo(dT)。
三、cDNA 第二链的合成
cDNA 第二链的合成方法有以下几种:
(1)
自身引导法合成的单链cDNA 3'端能够形成一短的发夹结构,这就为第二链的合成提供了现成的引物,当第一链合成反应产物的DNA:RNA
杂交链变性后利用大肠杆菌DNA 聚合酶Ⅰ Klenow 片段或反转录酶合成cDNA 第二链,最后用对单链特异性的S1
核酸酶消化该环,即可进一步克隆。但自身引导合成法较难控制反应，而且用S1 核酸酶切割发夹结构时无一例外地将导致对应于mRNA
5'端序列出现缺失和重排,因而该方法目前很少使用。
(2) 置换合成法该方法利用第一链在反转录酶作用下产生的cDNA:mRNA
杂交链不用碱变性,而是在dNTP 存在下,利用RNA 酶H 在杂交链的mRNA 链上造成切口和缺口。从而产生一系列RNA
引物,使之成为合成第二链的引物,在大肠杆菌DNA 聚合酶Ⅰ的作用下合成第二链。该反应有3 个主要优点: (1) 非常有效; (2)
直接利用第一链反应产物,无须进一步处理和纯化; (3) 不必使用S1 核酸酶来切割双链cDNA 中的单链发夹环。目前合成cDNA 常采用该方法。
四、cDNA 的分子克隆
已经制备好的双链cDNA
和一般DNA
一样,可以插入到质粒或噬菌体中,为此,首先必需连接上接头(Linker),接头可以是限制性内切酶识别位点片段,也可以利用末端转移酶在载体和双链cDNA的末端接上一段寡聚dG
和dC 或dT 和dA 尾巴,退火后形成重组质粒,并转化到宿主菌中进行扩增。合成的cDNA 也可以经PCR 扩增后再克隆入适当载体。
第二节动植物组织mRNA 提取
一、材料
水稻叶片或小鼠肝组织。
二、设备
研钵，冷冻台式高速离心机，低温冰箱，冷冻真空干燥器，紫外检测仪，电泳仪，电泳槽。
三、试剂
1、无RNA 酶灭菌水：用将高温烘烤的玻璃瓶（180℃ 2 小时）装蒸馏水，然后加入0.01%的DEPC（体积/体积），处理过夜后高压灭菌。
2、75%乙醇：用DEPC 处理水配制75%乙醇，（用高温灭菌器皿配制），然后装入高温烘烤的玻璃瓶中，存放于低温冰箱。
3、1×层析柱加样缓冲液；20mmol/L Tris?Cl(pH7.6)，0.5mol/L NaCl，1mmol/L EDTA(pH8.0)，0.1% SDS。
4、洗脱缓冲液：10mmol/L Tris?Cl (pH7.6)，1mmol/L EDTA (pH8.0)，0.05% SDS。
四、操作步骤
（一）动植物总RNA 提取-Trizol 法
Trizol
法适用于人类、动物、植物、微生物的组织或培养细菌，样品量从几十毫克至几克。用Trizol法提取的总RNA 绝无蛋白和DNA 污染。RNA
可直接用于Northern 斑点分析，斑点杂交， Poly(A)+分离，体外翻译，RNase 封阻分析和分子克隆。
1、将组织在液N 中磨成粉末后，再以50-100mg 组织加入1ml Trizol 液研磨，注意样品总体积不能超过所用Trizol 体积的10%。
2、研磨液室温放置5 分钟，然后以每1mlTrizol 液加入0.2ml 的比例加入氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心管15 秒。
3、取上层水相于一新的离心管，按每mlTrizol 液加0.5ml 异丙醇的比例加入异丙醇，室温放置10 分钟，12000g 离心10 分钟。
4、弃去上清液，按每ml Trizol 液加入至少1ml 的比例加入75%乙醇，涡旋混匀，4℃下7500g离心5 分钟。
5、小心弃去上清液，然后室温或真空干燥5-10 分钟，注意不要干燥过分，否则会降低RNA 的溶解度。然后将RNA 溶于水中，必要时可55℃-60℃水溶10 分钟。RNA 可进行mRNA 分离，或贮存于70%乙醇并保存于-70℃。
[注意] 1、整个操作要带口罩及一次性手套，并尽可能在低温下操作。
2、加氯仿前的匀浆液可在-70℃保存一个月以上，RNA 沉淀在70%乙醇中可在4℃保存一周，-20℃保存一年。
（二）mRNA 提取
由于mRNA 末端含有多poly(A)+，当总RNA 流径oligo(dT)纤维素时，在高盐缓冲液作用下，
mRNA 被特异的吸附在oligo(dT)纤维素柱上，在低盐浓度或蒸馏水中，mRNA 可被洗下，经过两次
oligo(dT) 纤维素柱，可得到较纯的mRNA。
1、用0.1mol/L NaOH 悬浮0.5-1.0g oligo(dT)纤维素。
2、将悬浮液装入灭菌的一次性层析柱中或装入填有经DEPC 处理并经高压灭菌的玻璃棉的巴斯
德吸管中，柱床体积为0.5-1.0ml，用3 倍柱床体积的灭菌水冲洗柱床。
3、用1x 柱层析加样缓冲液冲洗柱床，直到流出液的pH 值小于8.0。
4、将（一）中提取的RNA 液于65℃温育5 分钟后迅速冷却至室温，加入等体积2x 柱层析缓冲
液，上样，立即用灭菌试管收集洗出液，当所有RNA 溶液进入柱床后，加入1 倍柱床体积的1x 层析
柱加样溶液。
5、测定每一管的OD260，当洗出液中OD 为0 时，加入2-3 倍柱床体积的灭菌洗脱缓冲液，以
1/3 至1/2 柱床体积分管收集洗脱液。
6、测定OD260，合并含有RNA 的洗脱组分。
7、加入1/10 体积的3M NaAc(pH5.2)， 2.5 倍体积的冰冷乙醇， 混匀， -20℃30 分钟。
8、4℃下12000g 离心15 分钟，小心弃去上清液，用70%乙醇洗涤沉淀，4℃下12000g 离心
5 分钟。
9、小心弃去上清液，沉淀空气干燥10 分钟，或真空干燥10 分钟。
10、用少量水溶解RNA 液，即可用于cDNA 合成（或保存在70%乙醇中并贮存于-70℃）。
[注意] 1、mRNA 在70%乙醇中-70℃可保存一年以上。
2、oligo(dT)纤维素柱用后可用0.3mol/l
NaOH 洗净，然后用层析柱加样缓冲液平衡，并加入0.02%叠氮钠（NaN3)冰箱保存，重复使用。每次用前需用NaOH
水层析柱加样缓冲液依次淋洗柱床。第三节植物病毒RNA 提取大多植物病毒RNA 为单链RNA，并且其极性与mRNA 极性相同，植物病毒RNA
提取较为简单，一般使用酚氯仿即可获得满意结果。
