病毒包装技术6——腺病毒包装流程介绍
1. 细胞的准备
a) 复苏293细胞，传代培养1-2代，调整好细胞状态，务必4代以内完成转染实验。
b) 在转染前1天，用胰酶消化传代，将5×105细胞接种于6孔板或87.5px皿中，加入2ml完全培养基（DMEM+10%FBS+1%P/S+1%Glutamax），摇匀后置于5% CO2、95% 湿润空气、37℃培养箱中培养，以保证次日转染时细胞密度达70%左右。
2. 转染
a) 转染当天，从293细胞中移除培养基，分别换上新鲜的1.8ml DMEM+10%FBS培养基（不含抗生素），37℃孵育2h。
b) 配制转染试剂混合物
c) 使用转染试剂POLO3000：
d) A管：将4ug DNA与 100ul DMEM（基本），混匀；
e) B管：将6ul POLO3000与100ul DMEM（基本），混匀；
f) 室温放置5min后，将A管与B管溶液混合，轻轻混匀室温孵育15-20min；
g) 将上述复合物均匀滴加到293细胞中，轻轻摇匀细胞培养板，37℃培养箱中孵育。
3. 腺病毒包装
a) 转染24-48h后观察细胞状态，若质粒带荧光，可荧光显微镜下观察转染效率，此时荧光率约10-70%。细胞密度高于>90%需进行转盘，用胰酶消化细胞全部传到250px细胞培养皿中。
b) 此后每天观察细胞状态，每隔2天换一次培养基，每次换液8ml，直至有病斑（CPE）出现，之后换液采取半换即留3ml，再补5ml。
c) 传代后的第7-10天，细胞在10 cm培养皿中出现60%的CPE，大部分细胞崩解脱落，将细胞和培养液全部收集。
4. 腺病毒粗液的制备
a) 将收获的装有细胞培养上清及细胞碎片的离心管放于-80°C冰箱中。30min后，将管子放置于37°C水浴锅中，解冻15min，如此反复冻融两次以裂解细胞。
b) 将反复冻融的病毒液4℃ 3000rpm 离心15min，去除细胞碎片。
c) 将病毒粗提液1 ml/管分装于1.5ml离心管中，保存于-80°C冰箱。
5. 3.5 腺病毒液浓缩
a) 将上一步骤的病毒上清用0.45um的醋酸纤维素膜过滤，在过滤病毒液之前先用5ml DMEM完全培养基过滤润湿滤膜，以减少滤膜对病毒蛋白的吸附。
b) 将过滤之后的病毒液，置于Beckman高速离心管中，4℃，50000g，离心2h。
c) 离心完毕后，将离心管拿回安全柜中，小心倾倒上清，将离心管倒扣在吸水纸上沥干残液。
d) 取1ml预冷的DMEM，依次加入到离心管中，用剪去尖头的枪头，重复多次地半量吹打沉淀，轻柔操作，将离心管底部的沉淀完全重悬于DMEM溶液中，再用１ml DMEM润洗各管一遍，共得2ml病毒浓缩液。
e) 每管100ul小量分装与病毒专用管中，置-80度保存。
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