病毒包装技术——慢病毒生产及使用操作手册
一、实验流程
制备慢病毒表达质粒及其辅助载体，四个质粒共转染293T细胞，转染后6h更换为完全培养基，培养48和72h后，分别收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，病毒上清液通过超离心浓缩病毒。
二、实验材料
慢病毒载体包装系统为四质粒系统， 组成为Gag/pol、vsvg、rev及pLenti-X-EGFP表达载体。Polo3000转染试剂等。
三、包装细胞293T 细胞的培养
（一） 293T 细胞的冻存
随着传代的次数增加，293T 细胞会出现生长状态下降、突变等。为了防止此类现象的出现，我们需要在开始就对细胞进行大量冻存，以保证实验的稳定性和持续性。在细胞对数生长期进行冻存，增加细胞复苏成活率。
1、去掉上清液，加入PBS 洗去残留的培养基；
2、加入0.05%的胰酶，消化半1min 后，镜下观察细胞变圆，细胞间间隙加大时，去除胰酶，加入新鲜培养基吹打混匀，移入离心管中。
3、细胞计数，将细胞全部晃下，加入 2mL 37 ℃ 预热的 10％DMEM，用 10mL 移液管进行吹打，较大力吹打 6-8 次即可，不留死角，之后，将所有细胞吸出，置于15mL 离心管中，取 50ul 混匀后的细胞于 1.5mL eppendorf 管中，加 入 450ul 10％ DMEM，即为10 倍稀释，混匀，取 10ul 细胞于计数板 中计数。计数板上共 4 大格，每大格 16 小格。计数时，4 大格均计 数，总数除以 4（得每大格细胞数），再乘以 10（10 倍稀释），即 为实际 n 万/mL 细胞浓度。
4、细胞离心，1000rpm，5min。去掉上清。
5、根据细胞计数结果加入细胞冻存液（70%完全培养基+20%FBS+10%DMSO）,重悬细胞，密度为4 x 106 个/ml。
6、分装进细胞冻存管，放入冻存盒中，放入-80℃超低温冰箱。
7、第二天将细胞放于液氮罐中长久保存。
（二）293T 细胞的传代
当细胞生长到汇合率达到 80%~90%时需要对细胞进行传代操作，以扩大细胞数量，维持细胞良好的生长状态。
1、消化细胞，方法同细胞冻存。
2、细胞离心结束后，加入完全培养基重悬。
3、根据具体情况，将细胞分到10cm 培养皿中，每个培养皿补足到10ml 培养基。
4、将培养皿平稳放回37℃、5%CO2 的培养箱中培养。
（三）293T 细胞的复苏
当细胞传代次数过多，细胞状态变差时，或者细胞出现污染事故时，需要丢弃并对最初冻存的细胞进行复苏。
1、设置温度为37℃的水浴。
2、查看细胞库记录，根据记录从液氮罐中取出冻存的细胞（需戴上棉手套，防止被冻伤），迅速丢入水浴锅中并快速晃动，尽量在1min 内使细胞溶液完全溶解。
3、将细胞溶液转移到5ml 离心管中，并在其中加上1ml 新鲜的完全培养基，混匀后离心，1000rpm，5min。
4、去掉上清，加入2ml 新鲜的完全培养基，混匀沉淀后，转入6cm 培养皿。
5、将培养皿平稳放入37℃、5%CO2 和95%相对湿度的培养箱中培养。
6、第二天观察细胞存活率。给细胞换培养基。以后每天观察细胞生长情况。
四、慢病毒包装和浓缩
（一）293T 细胞培养
将细胞调整合适状态，在70%密度左右进行质粒共转染。转染前将细胞培养液换成无抗生素培养基。
（二）转染
将转染试剂Polo3000与基本培养基混合（用量请参考Polo3000试剂说明书），质粒DNA与基本培养基混合，室温孵育5min后将两者混合，放入37度培养箱孵育15min。再将混合液加入细胞培养皿中，混匀，细胞放入培养箱继续培养。转染后6h 换新鲜培液。
（四）病毒收集
转染后48 和72h 分别两次收集病毒上清)，收集后以0.45 μm 滤器过滤,于4℃，72000g/min 离心120 分钟；
（五）病毒重悬和保存
1ml PBS 重悬病毒沉淀，一周内使用则置于4 度冰箱保存，如需长时间存放需置于-80 度保存。
五、感染目的细胞
不同细胞的MOI 不同，在病毒感染目的细胞前，需要做预实验以确定细胞最佳MOI以及是否需要加入辅助增强剂Polybrene。
（一）细胞准备
将状态良好的目的细胞接种到24 孔板，使细胞浓度为2×105/ml细胞，接种细胞数量因细胞的生长速度而略有不同，一般是保证第二天进行病毒感染的时候细胞汇合率在50%左右。
（二）感染
一组添加polybrene， 另一组不加。MOI=10～50 内，每个MOI 值加2个孔，加入感染增强剂polybrene的一组使polybrene 最终浓度为8ug/ml, 24 小时后换液。（具体加入的病毒数可参考附表）
（三）48 小时后观察荧光表达情况,确定细胞的MOI 值及是否需要加入Polybrene。
