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蛋白质印迹法常见问题及解决方案分析

2022.11.11

常见问题及解决方案
问题	原因	解决方案
胶不平	玻璃板不干净	胶板洗刷干净；
催化剂或加速剂的量不合适	加入过硫酸铵和TEMED的量要合适；
试剂未混均，致使部分胶块聚合不均匀	加入试剂后摇匀，使其充分混合；
受热不均匀导致胶聚合不均匀	温度合适
凝胶漏液	玻璃板未对齐	两块玻璃板底部要对齐
条带比正常的窄	凝胶聚合不均匀	灌胶时候尽量混合均匀，动作轻缓；
加样孔扭曲	拔梳子要迅速，清洗加样孔要小心，以免把上样带扭曲
“微笑”条带	样品盐浓度过高会挤压其他条带导致宽窄不一	纯化样品，调整盐浓度
“倒微笑”条带	胶板底部有气泡会影响电泳效果	应赶走胶板底部气泡，同时注意电泳槽装置是否合适
凝胶肿胀或卷曲	取出凝胶后暴露空气中过久	可将凝胶在转膜之前放到转膜缓冲液中浸泡5~10min
条带歪斜或漂移	电转仪长期使用导致海绵变薄，“三明治”结构不紧凑导致	可在两块海绵之间垫上少许普通的草纸
单个或多个白点	膜与胶块之间有气泡	确保膜和胶块之间没有气泡
转膜缓冲液过热	缓冲液中离子浓度太低，电流或电压太高	转膜过程注意降温
背景过高	膜没有均匀浸湿	转膜前用100%甲醇将膜完全浸湿
膜或者缓冲液污染	拿取膜与吸水纸时要戴手套
封闭不充分	更换新鲜转膜缓冲液
抗体与封闭剂出现交叉反应	检测一抗、二抗与封闭剂是否有交叉反应
抗体浓度过高	杂交前检测一抗、二抗的工作浓度
封闭时间与清洗时间过长	减少封闭或清洗时间
上样量过大	合适的上样量
压片时间过长	缩短压片时间