多重PCR反应的优化方向--反应条件的优化
由于在一个多重PCR反应体系中有多对引物,而且扩增的模板片段长度也不尽相同,所以各对引物的扩增效率和扩增速度也不相同。
由于多重PCR反应总是遵循较小片段优先扩增的原则,各对引物所要求最佳PCR条件也不尽相同(设计多对引物进行多重PCR时,应使各引物所需PCR扩增条件尽可能一致),因此在选择多重PCR扩增条件(尤其是退火温度和时间)时应尽量选择有利于较大片段扩增的条件
(1)退火时间和温度在循环参数中,影响多重PCR扩增效率的主要因素是复性温度和延伸时间。复性温度的设置策略与单个PCR相似。先计算引物的熔解温度(Tm),在此基础上推算复性温度T。(T=T。-5)。然后用“逐步引人法”确定多重PCR的最佳T,即每增加一对引物,就根据扩增的结果调整复性温度,直至每一种被扩增的基因片段都获得满意的效果。延伸时间是影响扩增产量的重要因素。随着扩增的基因座数目的增加,延伸时间也应延长。在最佳的Mg2+和dNTP浓度范围内通过延长延伸时间来提高扩增产量,比单纯增加Mg2+和dNTP浓度更为有效。 退火时间对扩增效率的影响远远小于退火温度的影响,将退火温度降低4~6℃对于在多重PCR中扩增出同样的基因是必需的。多重反应中并发的其它基因的特异扩增会消除非特异扩增的影响,同样,扩增效率高的基因会使扩增效率低的基因的扩增产量降低 。
(2)延伸温度高的延伸温度会减少某些基因的扩增,即使用长的退火时间和延伸时间也可能无法消除这种影响。
(3)延伸时间在多重PCR中,由于同时扩增多个基因,酶和dNTP的缺乏就成为限制因素,就需要更多的时间来完成所有产物的合成。多重PCR中增加延伸时间,可以增加较长PCR产物的量。也有实验表明,当延伸时间延长时,所有基因的PCR产物量都增加了 4)PCR循环数PCR产物量增加最明显的是在25个循环附近。通常对于一个反应,2830个循环就足够了,增加至60个循环对产物量无明显影响 总之,多重PCR反应条件的设置是一个棘手的问题,也是多重PCR成功的保证。一般策略是首先进行单个PCR反应,分别设定各引物对应的条件;然后,依次增加引物对,不断调整反应条件直至最后保证所有的引物对都能在同一条件下扩增出目的条带。
