常规PCR反应的优化
A. DNA模板：
· 尽量使用高质量、纯化后的DNA作为模板
· 需要提高保真度时，可使用较高的DNA模板浓度并减少循环数
· 模板用量：以50 μl反应体系为例——
人基因组DNA：0.1~1.0 μg
大肠杆菌基因组DNA：10~100 ng
Lambda DNA：0.5~5 ng
质粒或病毒DNA：0.1~10 ng
B. 引物设计原则：
· 引物长度要满足特异性需要，一般可在18~25个碱基之间；扩增长片段时最好在24~30个碱基之间；
· 当引入克隆位点时，引物末端应额外增加3个以上碱基；
· (G+C)%含量应尽量控制在40~60%，两条引物的(G+C)%含量应尽量接近；
· 引物中GC碱基分布均匀；
· 尽量避免相同碱基连续出现三次以上，3’端应避免使用A或T；
· 避免引物内部自身配对形成二级结构；
· 正反向引物之间应避免配对碱基，尤其是3’端的三个碱基，否则易生成引物二聚体(Primer dimer)；
· 两条引物的解链温度（Tm）值应在42~65℃之间，而且两条引物间最好相差不超过5℃；
· 引物Tm值的计算方法：
20 nt以下：Tm = 2℃ x (A + T) + 4℃ x (G + C)
20 nt以上：Tm = 81.5 + 0.41 x (GC%) -600/nt (nt：引物的碱基数)
· 引物用量：
· 0.1~1.0 μM，通常可以0.2 μM起始，根据体系不同调整用量；
· 使用简并引物、随机引物时，需增加引物总量以弥补产量损失；但随着引物量加大，特异性将降低；
· 模板较大较多，或结构较复杂(如人基因组DNA)时，需减少引物用量以提高特异性；
· 模板较小较少(如质粒模板)时，增加引物用量可提高产量。
C. 核苷酸（dNTPs）：
· 常规dNTPs浓度为每种核苷酸0.1~1.0 mM，通常可以0.2 mM起始，根据体系不同调整用量；
· 低浓度（0.05~0.1 mM）可增加保真性，但会降低产量；
· 高浓度提高产量，尤其是长片段PCR，但会降低保真度。
D. 镁离子浓度
· 对于Taq DNA聚合酶，镁离子的最佳浓度为1.5~2.0 mM；
· 最佳浓度取决于模板、缓冲液、DNA和dNTPs（每一种都有可能鳌合镁离子）；
· 镁离子浓度过低，会降低产量；
· 镁离子浓度过高，会增加非特异性PCR产物；
· 优化镁离子浓度时，通常以0.5 mM梯度递增，最高到4 mM。
E. Taq DNA 聚合酶浓度
· 推荐使用浓度为 1~2.5 U/50 μl反应体系。
F. 起始反应
· 在冰上配制反应体系；
· 最后加聚合酶；
· 将热循环仪预热至变性温度(94℃)后，放入PCR管，立即进行反应。
G. 变性温度与时间
· 通常于94℃初始变性，使DNA双链完全打开；
· 变性时间通常为15~30秒；
· 避免长时间或高温度孵育；
· 高GC含量模板可提高变性温度至98℃。
H. 退火温度与时间
· 通常情况下，退火温度为引物Tm值减5℃，在55~60℃之间；
· 提高退火温度有利于减少非特异性条带；
· 常规退火时间为15~30秒。
I. 延伸温度与时间
· 延伸反应通常在72℃下进行。
· Taq酶的延伸时间大约为15~30秒/kb DNA；
· 产物小于1 kb时，建议延伸时间为30~60秒；
· 产物大于3 kb或反应超过30个循环时，可能需要更长的延伸时间。
典型的循环条件：
预变形94℃ 2 分钟
94℃ 30秒，
55℃ 30秒，
72℃ 1分钟/1 kb，25~30个循环
72℃ 5分钟
注：上述反应条件适用于普通Taq DNA聚合酶催化的PCR反应。当DNA模板富含GC、具有复杂二级结构、低浓度或产物>5 kb时可能需要改变相应条件。
