非洲爪蟾卵母细胞体外翻译系统（一）
实验材料 成年雌性非洲爪蟾抑肽酶tRNA蛋白酶 K
仪器、耗材 离心机 冷室
实验步骤
一、材料与设备
(一) 非洲爪蟾卵母细胞提取物的制备
1) 成年雌性非洲爪蟾：数只。
2) 高盐的 ModifiededBarth、X(MBS): 每升溶液中补加 1.28 gNaCl, 以使其终浓度达到 llOmmol/L。
3) 血浆促性腺激素和绒毛膜促性腺激素。
4) 溶液 A;2% 半胱氨酸的盐酸溶液，用 NaOH 调节 PH 至 7.7。
5) 溶液 B(抽提缓冲液）：100mol/LKCl,0.1 mmol/LCaCl2,1 mmol/LMgCl2,50 mmol/L 蔗糖和 10 mmol/LHEPES-KOH(pH7.7)
6)VersilubeVF50: 密度介于蛙卵和溶液 B 之间
7) 细胞松弛素 B: 在 4℃, 以储存于 DMSO 中
8) 抑肽酶: 在—20℃, 以 10 mg/ml 储存于水中
9)RNaseA：以 1 mg/ml 溶于水中；分装后存于一 20℃
10）核糖核酸酶抑制剂。
11)DTT:lmol/L，分裝存于-20℃。在加入抽提物之前应现稀释成 lOOmmol/L使用。
12)tRNA: 以 5 mg/ml 溶于水中，分装后存于一 20℃
13) 离心机。
14) 冷室。
(二）非洲爪蟾卵母细胞提取物的翻译
1) 磷酸肌氨酸：350 mmol/LL，储存于-20℃
2)[32S]-甲硫氨酸：100uCi/管分装, 储于一 70°C
3) 亚精胺：120 mmol/L，储存于一 20℃
4) 兔网织红细胞裂解液/S-100 提取物：如要去除反应中外源的核糖体，那么就必须制备 S-100 片段. 假如对外源性的核糖休并无特殊要求，那么可用经核酸酶处理过的网织红细胞裂解液代替 S-100 片段。制备 S-lOO 的方法.. 将 100ul 网织红细胞裂解液以 100000 g 离心 2 h，可得到约 80ul 的上清液。将上清以 10ul 的休积分装后，立即置入液氮中快速冷却，然后储于一 70℃ 备用。注意：在移出上清时不要吸入核糖体
5) 离心机
6) 冷室
(二）翻译产物的分析
1)10%TritonX-100: 在开封后，未用的溶液应于 4℃ 避光保存
2)PMSF
3)TritonX-100,1 mmol/LPMSF: 新鲜配制
4)2XT 缓冲液：100 mmol/LKCl,10 mmol/L 乙酸镁，200 mmol/LNaCl 和40 mmol/LTris-HCl(PH7.5)D 超滤火菌后存于一 20℃。产物可与 40% 的蔗糖储液混合，分别稀释成 1XT+10% 和 1XT+20% 蔗糖溶液，未使用的 lXT-f10% 和 1XT+20% 蓆糖溶液可存于一 20℃
5) 蛋白酶 K:25 mg/ml 储于 50% 甘油屮
6)Na2CO3: 对于每一个碱性蔗糖密度梯度分离实验，应新鲜配制 1mol/L 储液，其 100 mmol/h 溶液 PH 应为 11, 储液用水以 1:5 的比例稀释成 200 mmol/L 的使用液. 用以处理膜片段。另外，储液还可以与 40% 的蔗糖溶液混合（1 体积的 1moL/L4 体积的水和 5 体积的 40% 的蔗糖溶液）以制成 20% 的蔗糖密度梯度。
7)1mol/LHCL
8) 丝氨酰醅氨酰天冬酰胺（ThrTyr-Asn): 由于其在水中的溶解件不好，因此储液一般用 DMSOS 成 lOOmmol/L 使用时，吋用储液做相应稀释。
9) 离心机。
10) 冷室.
二、操作方法
(一）非洲爪蟾卵母细胞提取物的制备
1. 基本提取物的制备
整个操作过程进行得越快. 所得的最终提取物的翻泽效果就越好，因此，在开始制备提取物之前，应务必确定是否所有的缓冲液、试管和离心机转子都预冷到 4°C，以及确定所有必需的材料都备齐。另外，除非温度被特别指出，否则在上述的笫 2) 步之后的所有步骤都应在 4°C 冷室中置于冰浴上迸行
1) 挑选较大的成年雌性非洲爪蟾数只，于第 1 天给每只注射 50〜1O0U 的血浆促性腺激素，3〜5 天之后，即在制备提取物的前一天晚上再向每只非洲爪蟾注射 500〜750U, 绒毛膜促性腺激素，以诱 K 排卵。之后，非洲爪蟾被放置过夜，并使之将卵排到商盐的 MBS 中，以保持卵的生物学活性
2) 将约 30 ml 的松散结合的卵转移到一个 250 ml 的广口玻璃杯中，用高盐的 MBS 反复冲洗几次后，用塑料移液管吸去细胞碎片以及已死亡的卵细胞。尽可能多的去除上清缓冲液加人 100 ml 溶液 A, 重复以上操作 2〜3 次。^不时涡旋振动悬浮的卵，并持续 5〜lOmin 当蚌卵所占的体积显著性的减少时，说明卵外层的胶状衣鞘已逐渐溶解。此时，闻用溶液 A 冲洗蛙卵，然后弃去溶液，重复儿次后将蛙卵转人冰预冷的溶液 B 中，
3) 用广口移液管耗轻将蛙卵吸到 4 个 2 ml 的离心管巾，在此过程中应尽可能少的吸入浴液 B 上，蛙卵靜置约 1 min 后仔细地吸去上清，然后在液面上梗盖一层 VersihjbeVF50, 并于 4℃ 以 500 g 离心 1 min。离心后，蛙卵应紧靠在一起，但不应破裂。离心结束时. 溶液 B 应位于最上层，Vei^lubeVF50 层位于中间，而蛙卵则位于最下层。
4) 用 200ul 移液器小心地移去上层缓冲液及油层，然后将离心管置于离心机中，于 4℃ 以 20000 g 离心 15 min, 以裂解蛙卵。预期的离心产物山多层细胞裂解产物所组成，而其中黏稠的琥珀色的屮间层大约占 40% 的体积，这就是目的产物，即细胞质。用塑料移液管穿过脂质的薄层插入到中间层中. 使细胞质转移出来。
5) 从所有的离心管中将产物一移出，估汁体积后按 5ul/ml 的量加入 10 mg/ml 的细胞松弛素\轻轾吹打混匀后，将混合物转入新的 1.5 ml 离心管中，于 4℃ 以 20000 g 离心 15 min，离心后, 细胞质应占绝大多数的休积，在将其移出时，应十分小心以避免吸出底部的沉淀。
6) 按 1ul/ml 的量加入 10 mg/ml 抑肽酶，轻较充分混匀。
提取物可以用于翻译反应、冻存，也可按如下步骤对其中的内源性 mRNA 进行去除。
2. 内源性 mRNA 的去除
像制备基本提取物时一样. 内源性 mRNA 的去除也最好在冷室中进行。
1) 稀释 RNaseA 储液的浓度到 100X 的使用液。
2) 按 lul/管的量向具有螺旋盖的 1.5 ml 的离心管屮加入稀释好的 RNawA, 然后向每管中加入 100ul 提取物，上下吹打混匀。置 10℃ 孵育 I5 min
3) 将离心管背于冰上，按 1ul/管的量加入 100 mmol/LDTT，接着按 50U/管的量加入 RNa 此抑制剂。充分混匀，置 10℃ 孵育 15 min,, 按 2ul/管的最加入 5 mg/mltRNA.去除了内源性 mRNA 的提取物可以立接用于翻译反成，或尽快冻如液氮中备用
