非洲爪蟾卵母细胞体外翻译系统（二）
(二）外源 mRNA 在非洲爪蟾卵母细胞提取物中的翻译
1) 室温融化冻存的提取物，然后即置于冰上。
2) 同时，应将用于翻译的 mRNA 分装于 0.5 ml 或 1.5 ml 离心管中，置于冰上
3) 每 100ul 提取物应分別加入以下各成分：10ul 网织红细胞裂解液 S-100,1ul120 mmol/L 精胺，2.5ul350mol/L 磷酸肌氨酸和 lO0ulCi[35S]-甲硫氨酸。按 10〜50ul/管的量向盛有 mRNA 的离心管屮加入此种混合物，混合均匀后，置 21℃ 孵育 lh
4) 如果具有高放射件活性的体外合成 mRNA 被用于翻译，则在反应结朿时应加入lOug/mlRNaseA 并置于 21°C 孵育 15 min，以除去由放射性 mRNA 带来的将会妨碍进一步分析的放射性背景。
5) 如需储存，反应可在此步通过冷冻加以终止
6）如用凝胶电泳分析或 TCA 沉淀反成，在加入等体积的 2XSDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳加样缓冲液或筛选过滤前, 应向反应产物加入 1%X-100 和 lmmol/LPMSF
(三）翻译产物的分析
对翻泽产物逬行普通的凝胶电泳常常可揭不其分泌表型：假如位爭肽序列被切割，则
分子质览通常町减少 2k〜3kDa; 如果发生糖基化，则产物的迁移宇通常比麦胚提取物或网织红细胞裂解液翻译产牛的末修饰的蛋白的辽移率有相对的降低。由于其他原因也对能导致迁移率改变，所以我们可以通过蛋 H 酶保护反说或者蔗糖密度梯度离心来确定
导致迁移率改变的真正原因=碱性蔗糖密度梯度离心能用于确定蛋白是否是否自由存在于内质网腔中或是整合十膜上，而特异的 N-糖基化的抑制可能表现为表面上的分子质量的增加。
1. 蛋白酶保护反应
1) 从转录反应体系屮取出 3X10ul 的反应液用于实验，并置于冰上。假如必须使用少于 10ul 的反应液, 例如当产物要用于多种方法分析时. 可加入 4 倍体积的 1XT 缓冲液+10% 蔗糖对反应液进行稀释。
2) 向毎个试管中加入 1ul 的 10％TrimnX-100 以裂解存在的膜，并提供一个蛋白质水解酶的阳性对照。
3) 在 10% 的蔗糖溶液屮加入 1ul1/ml 的蛋白酶 K 溶液并同时加人 Triton(二个样品屮冇一个不添加，以作为加工过程中的稳定性对照）置于冰上 1 h
4) 用 3 倍体积的 10% 蔗糖溶液对 lOOmmol/LPMSF 进行稀释: 按 1ul/反应的试加入 PMSF，使其终浓度达到 2〜2.5 mmol/L，并继续在冰上孵育 15 min。
5) 加入 lOOul2XSDS 聚丙烯酰胺凝胶屯泳加样缓冲液其中包括 1%TntonX-100). 沸水浴 5 min, 如样品在进行蛋白酶处沔前进行了稀释，应加入更少体积的 2XSDS 聚丙烯酰胺凝胶屯泳加样缓冲液，以使最终混合物中提取物的体积不少于 10%。
6)SDS 聚两烯酰胺凝胶电泳分析 (其中包括-管来自同—反设体系的经相同稀释的未作处理的样品. 并将之作为标记物）。
2. 中性蔗糖密度梯度分离
蔗糖密度梯度分离不但可作为分析的工貝. 而旦能对样品中的翻泽产物作活性分析前的纯度分析。
假设按照如下所述的碱性蔗糖密度梯度分离，建议将反应的起始体积设为最少 50ul, 即这样体积就更容易控制。
1) 于冰上用 10 倍体积的 1XT 缓冲液+10% 蔗糖溶液对样品进行稀释. 留一点样品作为 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳的标记物，然后小心的将剩余的部分铺于盛有 1 ml1XT缓冲液蔗糖溶液的 1.5 ml 离心管中。
2) 于 4℃、40000 g 离心 30 min。
3) 回收顶端包含细胞质蛋白的液层（10% 蔗糖溶液），操作时应避免此液层与 20% 蔗糖溶液层的互溶，以提高产物的纯度。移出并弃余下的蔗糖缓冲液，小心不要触动管底的呈褐色的膜珠。
4) 如果膜的稳定性对于蛋白酶保护反应或碱性蔗糖密度梯度分离等实验是必需的，则首先用前述蔗糖密度梯度的一半体积的 1XT 缓冲液十 20% 的蔗糖溶液轻轻重悬膜珠，然后分别加入 TritonX-100 和 PMSF 至终浓度为 1%X-100 和 Immol/LPMSF，以溶解膜珠。
5) 通过 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳对总反应产物以及每一组分进行分析.
3. 碱性蔗糖密度梯度分离
碱性处珅可以破坏襄泡膜，释放放囊泡内的蛋由，但并不溶解脂质双分子层。在经蔗糖密度梯度分离后，囊泡蛋白将仍留在上清中，而膜结合的组分将以小珠的形式沉淀下来。
1) 取（三）翻译产物的分析」中的 2 中的「中性蔗糖密度梯度分离」屮的第 4) 步所得的 1OOul 膜溶液，加人等体积的 200 mmol/LNa2C03，置冰上孵育 30 min。
2) 取上步所得的膜 250ul 的 Na2C03 溶液平铺于盛有 lml20% 蔗糖溶液的 1.5 ml 离心管中，于 4℃ 以 100000 g 离心 1 h
3) 移出 100〜150ul 上清，注意：此处允许小部分的损失，不要全部移出。去除 20%的蔗糖溶液后，用 1%TritonX-100,1 mmol/LPMSF 重新溶解膜珠。
4）在进行 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳分析前，应加入大约占总体积 10% 的 lmol/L 的HCL 以中和上淸液。注意：HC1 应缓缓加入，井不断搅拌混匀，以防止局部的蛋白质变件沉淀。另外，在此过程中应不断用 pH 试纸检测溶液 pH, 以防 HC1 过量
4. 特异的 N-糖基化抑制
传统上，位于多肽链上的 N-糖基化位点可通过能特异对其进行切割的内切糖苷酶 H 来测这里将介绍一种在策略下完全不同的新方法，通过加入竞争性的 Thr-Tyr-Asn'肽序列可以特异件的抑制非洲爪蟾提取物屮体外翻译多肽的糖基化，以揭示所翻译的多肽序列是否进行了 N-糖基化
1) 准备两组浓度经系列稀释的二肽水溶液，其浓度范围为 1.5〜50mol/L
2) 在冰上准备好-个至少 80UL 的休外翻译反应系统，其中应包含用于翻译成目的蛋白的 mRNTA。
3) 在每 9ul 翻译反应液中加入 lul 的经系列浓度梯度稀释的三肽溶液。另外，取一份 9ul 的翻译反应液加入 1ulDMSO 以代替三肽溶液作为 DMSO 对应应影响的对照。将这些混合物 S 剩余的作为阳性对照的反应物共问于 21℃ 孵育 1 h。然后对样品进行 SDS 聚内烯酰胺凝胶电泳分析，其中应包括一个经网织红细胞裂解液翻译的未糖基化蛋白作为标志物，从电泳结果中应可以看出，被特异抑制的糖基化的蛋比已经糖基化的蛋白泳动速度要快
注意事项
1) 与任何体外翻译系统一样，非洲爪蟾卵母细胞体外翻泽系统也应注意尽量避免其内含物具有 RNase 活性。
2) 不同的雌性爪蟾所排出的卵之间的质量是存在差別的，因此在使用前应对卵的活性进行检测。检测卵的受精能力是较为有效的方法。
3) 在极其偶然的情况下，一批卵可能不能很好的裂解。这种情况发生的显著性标志是，在制备过程中经第一次离心后提取物不是呈琥珀色而是呈灰色. 这种提取物不能很好的进行体外翻评，因此应放弃不用
4) 如用于冻存，应将提取物按 l00ul//管或更少的量分装到经冰预冷的离心管中，然后置于液氮中 1 min, 冷冻后，提取物最好存于液氮中，但如存于一 70℃ 也可保存其活件数月。
5) 如用冻苻的提取物进行翻译反应，应避免进行如 T 操作：即在融化的提取物中加入所需的各种试剂. 然后将反应物一分为_并分别进行翻泽反应。因为经这样操作后，提取物的浓度会被稀释，这将大大影响其反应活性。
6) 不同的来源和批次的 RNNaseA 的纯度是不冋的，因此每一批次使用前应进行滴定，以确定其最适使用浓度。RNNaseA 便用浓度一般为 0.1〜5ug/ml, 浓度过低不能去除内源性 RNA 的干扰，而过高则会降解后加入的外源性 mRNA。
7) 在非洲爪蟾卵母细胞体外翻译系统中，大多数来源于比作洲爪擔更高等的真核生物的 mRNA 时以得到很好的翻译, 但是原核生物的 mRNA 却不行。另外，天然的 mRNA 比体外合成的 mRNA 的翻译效率要高.
8) 用于体外翻译的 mRNA 的量在很大程度上取决于其来源与活性。通常，体外合成的 mRNA 的用量一般为约 50ug/ml，而poly(A)+mRNA 的用量为 100〜200ug/ml, 这个用量并未超出提取物进行体外翻泽后修饰的能力。假如超出此用 1，则分泌性蛋白的有效分泌将会显著下降，N-糖基化效率将会大幅度降低. 但是，即便使用非常高的 mRNA 的量，也未发现有信号肽末经剪切的情况出现
9) 提取物中的甲硫氨酸的含最大约是 35umol/L(±10%)，因此可以通过 TCA-沉淀反应的产物中 [35S]〜甲硫氨酸所占的打分比来估计个反应的蛋白质产景。当用单克隆的 mRNA 进行反应时，产物屮甲硫氨酸的含 t 能被精确的计算得到；但当用 poly(A)1mRNA 时. 甲硫氨酸的含最一般被合砰的估计为 2%。如翻译反应的£3 标是尽町能多的获得蛋白质时，那么我们可以通过添加过量的氨基酸以使蛋白的产量增加约体做法是：向提取物中加入约 5% 体积的包含 700umol/L 的甲硫氨酸和 2 mmol/L 的所有其他各种氨基酸。
10) 作体外翻译反应中：[35S] 甲硫氨酸常常被使用，这不仅因为它来源方便，而且因为它在提取物中的含量较低，此可产生较好的信号. 但是，当目的蛋白质的甲硫氨酸含极低或是根本不含甲硫氨酸时，可用其他的氨基酸代替甲硫氨酸用于反应。但是，其前提是这些氨基酸要像甲硫氨酸一样在非洲爪蟾卵母细胞中的含量有限，例如：半胱氨酸、亮氨酸、组氨酸和脯氨酸。
11) 最好在翻译反应结東时就立即进行蔗糖密度梯度分离反应或蛋白酶保护反应
12) 在蛋白酶保护试验中，一些信号肽位于胞质屮的穿膜蛋白会因为所添加的蛋白酶 K 的剪切作用而使肽链长度有所减少。
