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ISSR（inter-simple sequence repeat）分子标记的实验原理及操作

2020.9.01

ISSR标记
ISSR（inter-simple sequence repeat）标记是一种类似RAPD，但利用包含重复序列并在 3’或5’锚定的单寡聚核酸引物对基因组进行扩增的标记系统，即用SSR引物来扩增重复序列之间的区域。其原理具体是，ISSR标记根据生物广泛存在 SSR的特点，利用在生物基因组常出现的SSR本身设计引物，无需预先克隆和测序。用于扩增的引物一般为16-18个碱基序列，由1-4个碱基组成的串联重复和几个非重复的锚定碱基组成，从而保证了引物与基因组DNA 中SSR的5’或3’末端结合，导致位于反向排列、间隔不太大的重复序列间的基因组节段进行PCR扩增。

一、实验材料
　　不同来源的 DNA(30-50ng/ul)。

二、实验设备
　　PCR仪，PCR管或硅化的 0.5ml eppendorf管，电泳装置，凝胶成像仪。

三、试剂
　　1、 ISSR引物：购买成品或根据加拿大British Columbia大学设计的ISSR引物序列（见附录）自己合成。
　　2、Taq酶
　　3、10xPCR 缓冲液
4、MgCl2：25mmol/L。
　　5、 dNTP：2.5mmol/L。
四、操作步骤：
　　1. 在25ul反应体系中，加入
　　　　模板DNA 1ul (30-50ng)
　　　　ISSR引物 1ul (约5pmol)
　　　　10xPCR Buffer 2.5ul
　　　　MgCl2 2ul
　　　　dNTP 2ul
　　　　Taq酶 1单位（U）
　　　　加ddH2O 至 25ul
　　混匀稍离心, 加一滴（约20 ul）矿物油。
　　2. 在PCR仪中预变性94℃ 2分钟, 然后循环: 94℃ 1分钟， 45℃-68℃ 40秒， 72℃ 1-2分钟，共40轮循环。
　　 3. 循环结束后, 72℃ 10分钟，4℃保存。
　　4. 取PCR产物15ul加3ul上样缓冲液(6x)于1.6% 或1.8% 琼脂糖胶上电泳, 稳压50-100Ｖ（电压低带型整齐，分辨率高）。
　　5. 电泳结束，溴化乙锭染色20分钟。
6. 用凝胶成像仪观察、拍照。
注：样品可以采用新鲜样品，硅胶干燥样品，标本等
DNA提取可采用CTAB或SDS法
DNA质量检测可用紫外分光光度计法和电泳法
附录 UBC Primer Set #9 (Microsatellite)

引物名称	序列	引物名称	序列
801	ATA TAT ATA TAT ATA TT	851	GTG TGT GTG TGT GTG TYG
802	ATA TAT ATA TAT ATA TG	852	TCT CTC TCT CTC TCT CRA
803	ATA TAT ATA TAT ATA TC	853	TCT CTC TCT CTC TCT CRT
804	TAT ATA TAT ATA TAT AA	854	TCT CTC TCT CTC TCT CRG
805	TAT ATA TAT ATA TAT AC	855	ACA CAC ACA CAC ACA CYT
806	TAT ATA TAT ATA TAT AG	856	ACA CAC ACA CAC ACA CYA
807	AGA GAG AGA GAG AGA GT	857	ACA CAC ACA CAC ACA CYG
808	AGA GAG AGA GAG AGA GC	858	TGT GTG TGT GTG TGT GRT
809	AGA GAG AGA GAG AGA GG	859	TGT GTG TGT GTG TGT GRC
810	GAG AGA GAG AGA GAG AT	860	TGT GTG TGT GTG TGT GRA
811	GAG AGA GAG AGA GAG AC	861	ACC ACC ACC ACC ACC ACC
812	GAG AGA GAG AGA GAG AA	862	AGC AGC AGC AGC AGC AGC
813	CTC TCT CTC TCT CTC TT	863	AGT AGT AGT AGT AGT AGT
814	CTC TCT CTC TCT CTC TA	864	ATG ATG ATG ATG ATG ATG
815	CTC TCT CTC TCT CTC TG	865	CCG CCG CCG CCG CCG CCG
816	CAC ACA CAC ACA CAC AT	866	CTC CTC CTC CTC CTC CTC
817	CAC ACA CAC ACA CAC AA	867	GGC GGC GGC GGC GGC GGC
818	CAC ACA CAC ACA CAC AG	868	GAA GAA GAA GAA GAA GAA
819	GTG TGT GTG TGT GTG TA	869	GTT GTT GTT GTT GTT GTT
820	GTG TGT GTG TGT GTG TC	870	TGC TGC TGC TGC TGC TGC
821	GTG TGT GTG TGT GTG TT	871	TAT TAT TAT TAT TAT TAT
822	TCT CTC TCT CTC TCT CA	872	GAT AGA TAG ATA GAT A
823	TCT CTC TCT CTC TCT CC	873	GAC AGA CAG ACA GAC A
824	TCT CTC TCT CTC TCT CG	874	CCC TCC CTC CCT CCC T
825	ACA CAC ACA CAC ACA CT	875	CTA GCT AGC TAG CTA G
826	ACA CAC ACA CAC ACA CC	876	GAT AGA TAG ACA GAC A
827	ACA CAC ACA CAC ACA CG	877	TGC ATG CAT GCA TGC A
828	TGT GTG TGT GTG TGT GA	878	GGA TGG ATG GAT GGA T
829	TGT GTG TGT GTG TGT GC	879	CTT CAC TTC ACT TCA
830	TGT GTG TGT GTG TGT GG	880	GGA GAG GAG AGG AGA
831	ATA TAT ATA TAT ATA TYA	881	GGG TGG GGT GGG GTG
832	ATA TAT ATA TAT ATA TYC	882	VBV ATA TAT ATA TAT AT
833	ATA TAT ATA TAT ATA TYG	883	BVB TAT ATA TAT ATA TA
834	AGA GAG AGA GAG AGA GYT	884	HBH AGA GAG AGA GAG AG
835	AGA GAG AGA GAG AGA GYC	885	BHB GAG AGA GAG AGA GA
836	AGA GAG AGA GAG AGA GYA	886	VDV CTC TCT CTC TCT CT
837	TAT ATA TAT ATA TAT ART	887	DVD TCT CTC TCT CTC TC
838	TAT ATA TAT ATA TAT ARC	888	BDB CAC ACA CAC ACA CA
839	TAT ATA TAT ATA TAT ARG	889	DBD ACA CAC ACA CAC AC
840	GAG AGA GAG AGA GAG AYT	890	VHV GTG TGT GTG TGT GT
841	GAG AGA GAG AGA GAG AYC	891	HVH TGT GTG TGT GTG TG
842	GAG AGA GAG AGA GAG AYG	892	TAG ATC TGA TAT CTG AAT TCC C
843	CTC TCT CTC TCT CTC TRA	893	NNN NNN NNN NNN NNN
844	CTC TCT CTC TCT CTC TRC	894	TGG TAG CTC TTG ATC ANN NNN
845	CTC TCT CTC TCT CTC TRG	895	AGA GTT GGT AGC TCT TGA TC
846	CAC ACA CAC ACA CAC ART	896	AGG TCG CGG CCG CNN NNN NAT G
847	CAC ACA CAC ACA CAC ARC	897	CCG ACT CGA GNN NNN NAT GTG G
848	CAC ACA CAC ACA CAC ARG	898	GAT CAA GCT TNN NNN NAT GTG G
849	GTG TGT GTG TGT GTG TYA	899	CAT GGT GTT GGT CAT TGT TCC A
850	GTG TGT GTG TGT GTG TYC	900	ACT TCC CCA CAG GTT AAC ACA