小鼠骨髓来源树突状细胞（BMDC）的培养（三）
【经典的BMDC培养法】-Inaba法（改良）[3,10]
¾ 背景：
1. Inaba法获得的BMDC数目为5-7 x 106个/小鼠；
2. Inaba原法操作比较复杂，需要将骨髓中的淋巴细胞等用抗体+补体法预先去除， 后来的改良法均省却了这个步骤，其实Inaba后来自己也说这个步骤虽然可提高BMDC的纯度，但不会对BMDC的生成产生影响，可做可不做 [10]；
3. Inaba原法仅用GM-CSF来诱导BMDC的产生，虽然得到的BMDC在混合淋巴 细胞反应中有较强的刺激能力，但DC的成熟度不及GM+IL-4的联合诱导，所以后来的改良法中多用GM+IL-4联合诱导。
¾ 培养步骤：
1. 小鼠骨髓细胞的获得
1.1 小鼠（6-10周龄）颈椎脱臼法处死，手术取出所有股骨（femurs）和胫骨（tibias），并剪刀和镊子将骨周围的肌肉组织尽量去除干净；注：不要损伤到骨。
1.2 将骨移至超净台内，并用盛有70%酒精的无菌培养皿浸泡2-5 min，以消毒灭 菌，然后用无菌的PBS洗2次；
1.3 将骨移入另一个盛有PBS的新培养皿中，用剪刀剪去骨两端，再用注射器抽取PBS，针头分别从骨两端插入骨髓腔，反复冲洗出骨髓至培养皿中，直至骨完全变白；
1.4 收集骨髓悬液，用200目尼龙网滤去小碎片和肌肉组织；
1.5 滤过液1200rpm离心5 min，弃上清；
1.6 加入2 ml氯化铵红细胞裂解液（1x），重悬细胞，室温孵育 3-5 min,最长 10min；氯化铵红细胞裂解液的配制：
注：1）先配制10x
的贮存液，配法如下：称取 82.9 g NH4Cl,10.0 gKHCO3 和 0.37 g Na2EDTA,溶于1L的蒸馏
水中，0.22μm 滤膜过滤除菌，4oC储存6个月；注：可根据需要配制适量的10x 贮存液，其中各组分需成比例增减。
注：2）临用前，将10x 贮存液用无菌蒸馏水1:9稀释成1x 工作液即可。因氯化铵红细胞裂解液对骨髓细胞有一定的伤害作用，所以要尽量缩短溶血时间。
1.7 加入10ml PBS中和裂解液的作用，然后1200 rpm离心5 min,弃上清；
1.8 PBS洗1次，然后用含10% FBS的RPMI 1640培养液重悬细胞，至此已获得小鼠骨髓细胞。
2. BMDC的诱导分化
2.1 步骤1中获得的小鼠骨髓细胞计数后用含10% FBS 的RPMI 1640完全培养液调整细胞浓度为0.5-1x106/ml;
2.2 铺至24孔培养板内，每孔1 ml细胞，同时加入重组小鼠 GM-CSF（20 ng/ml）和IL-4（10 ng/ml），37℃，5% CO2培养箱培养，此为培养的第0天；
注：1） 一般一只小鼠大约可收获4-5 x 107个骨髓细胞，所以可以铺至少40-50个24孔板板孔。
2） GM-CSF和IL-4的使用浓度区间分别为20-50 ng/ml和10-40 ng/ml。
2.3 每2天轻轻摇晃培养板，然后3/4体积更换新鲜培养液，并补足细胞因子。
注：1） 此步骤的目的是去除粒细胞和淋巴细胞，因粒细胞和淋巴细胞为悬浮生 长；
2） Inaba 认为培养的前4天，大部分DC贴壁仍较牢，所以此法不会大量损失 DC；
3） 若发现损失的DC细胞过多，可仅在培养的第2天用此法换液；
4） 在培养的第4天，可以看到聚团生长的DC贴附于板底，第6天则可观察到很多DC成集落生长。
2.4 在第5天和第8天之间，轻柔吹打培养液，收集悬浮细胞及巯松贴壁生长的细 胞；
注：1） 最佳收集时间是培养的第6天；
2） 此时的细胞已经是BMDC,但成熟度不高，所以需要后续的再铺板（subculture）步骤使其更成熟；
3） 吸出培养液（含DC细胞）的24孔培养板需补充新鲜的含重组小鼠GM-CSF（20ng/ml）和IL-4（10 ng/ml）的 RPMI 完全培养液，继续培养， 以便后面能够再次收集BMDC。
2.5 1200 rpm离心5 min，弃上清；
2.6 用含10% FBS的RPMI 1640完全培养液重悬细胞并计数，然后调整细胞浓度 至1 x 106/ml,并加入重组小鼠GM-CSF（20ng/ml）和IL-4（10ng/ml）；
2.7 细胞铺板至100 mm培养皿（每皿最多10ml）或6孔培养板（2m/孔）。
2.8 37℃，5% CO2培养箱继续培养1-2天；
2.9 收集悬浮细胞，即为较成熟的BMDC。
注：1） 第2.5-2.8步为再铺板（subculture）步骤，目的是使第2.4步获得的BMDC更加成熟。
2） 再铺板后的3 h内可见许多棘状贴壁细胞从DC簇中迁移出来，而培养1天后会发现这些贴壁细胞从培养板底脱离，而且可以看见在培养液中漂浮着许多典型的DC.
