小鼠骨髓来源树突状细胞（BMDC）的培养（五）
¾ 培养步骤：
1. 小鼠骨髓细胞的获得
见Inaba法（改良）中的相应步骤，注意省去溶血步骤。
2. BMDC 的大量制备
2.1 步骤1中获得的小鼠骨髓细胞计数后用含 10% FBS的RPMI 1640完全培养液调整细胞浓度为2 x 105/ml;
2.2
铺至100 mm细菌培养皿（Petri Dish） 中，每皿10 ml细胞，同时加入重组小鼠GM-CSF（200
U/ml,对于PeproTech的GM-CSF,相当于20 ng/ml），37℃，5%
CO2培养箱培养；注：此处使用的是细菌培养皿，而非细胞培养板。
2.3 第3天时，向培养皿中再加入10 ml含20 ng/ml重组小鼠GM-CSF的完全培养液；
2.4 第6天和第8天分别半量换液，即收集旧培养液，离心后用含20 ng/ml重组小鼠GM-CSF的完全培养液重悬细胞沉淀，然后再将细胞悬液放回原皿；
2.5 第10天时可收集细胞，即为BMDC。
注：1）此时也可继续培养至第12天。若继续培养，可使用30-100 U/ml（即3 ng-10 ng/ml）的重组小鼠GM-CSF.
2）虽然培养时间越长，细胞表型上越成熟（CD11c的表达量高），但混合淋巴细胞反应实验显示，培养第8天和第10天收获的BMDC具有最强的刺激能力，而培养第12天的BMDC刺激能力明显减弱。
3）经过10天的培养，每皿平均可收获9.2 x 106个细胞。
3. BMDC的完全成熟
3.1 培养第10天的DC用移液器轻轻吹打收集悬浮细胞，300 x g室温离心5 min；
3.2
弃上清，用10 ml RPMI 1640完全培养液重悬细胞沉淀，然后铺于100
mm细胞培养板；注：此处不再用细菌培养皿，而是用细胞培养板，因
BMDC已形成，呈半悬浮状态，骨髓中残留的巨噬细胞前体虽然可贴附于细胞培养板，但不再会对DC的成熟起到抑制作用，反而会因为其贴于板底而使悬液中的DC的纯度更高。
3.3 加入重组小鼠GM-CSF（100 U/ml , 相当于PeproTech的10 ng/ml）和TNF-α（500 U/ml），或重组小鼠GM-CSF（100U/ml,相当于PeproTech 的10ng/ml）和LPS（1 μg/ml）；
3.4 37℃，5% CO2培养箱继续培养1-2天。
【BMDC的鉴定】
1. 形态学观察：BMDC 多数呈集落生长，细胞有多个树突样突起，成熟的 BMDC 更加 明显；
2. 细胞表型分析：流式细胞术检测DC细胞表面 CD11c,CD40,CD80,CD86,MHC II类分子（I-A/I-E） 等的表达，BMDC高表达这些分子，完全成熟的BMDC中这些分子的表达会进一步提高。
3.混合淋巴细胞反应（MLR）：BMDC具有较强的刺激能力，且成熟度越高，刺激能力越强。
摘自文献 Lutz MB, et al. J Immunol Metods. 1999; 223（1）： 77-92 [8]
