免疫沉淀实验
基本方案
制备抗体Sepharose 偶联物
抗Ig血清免疫沉淀放射性标记抗原
免疫沉淀放射性标记抗原
| 实验材料 | 蛋白质 |
|---|---|
| 试剂、试剂盒 | 裂解缓冲液 稀释缓冲液 SDS Tris TSA |
| 仪器、耗材 | 转子 离心机 |
| 实验步骤 |
1. 表面标记或生物合成标记的细胞在裂解缓冲液中于4℃放置1 h 后，再于4℃3 000 g 离心10 min 除去细胞核，然后将所得上清在10000 g 离心1 min。
2. 一次性对上清进行预处理，每200 μl 上清加入10 μl 活化后被淬灭的琼脂糖对照。在旋转揺床中室温揺荡2 h 或在4℃过夜。200 g 离心1 min，保留上清。
3. 在1.5 ml 的微量离心管中加满裂解液室温作用10 min，对其进行预包被。吸去液体后，加入105~106 cpm 的含抗原的放射性标记上清，加稀释缓冲液使终体积为200 μl。
4. 加入10 μl 1：1的抗体-Sepharose偶联物胶浆/稀释缓冲液。4℃在旋转摇床中摇荡1. 5~3 h，一直保持Sepharose呈混悬状。
6. 加入20~50 μl SDS样品缓冲液。由于样品缓冲液比重大于洗涤缓冲液，它可渗透到Sepharose中，不要用旋涡混合器旋起SEpharose，以免使之粘附在缓冲液液面以上的管壁。盖紧盖子，于100℃保温5 min。
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