荧光定量PCR检测HBV DNA准确性的影响因素及解决措施
现在国内多数三级医院都用自动荧光聚合酶链式反应(PCR)扩增仪检测乙型肝炎病毒(HBV)DNA。但在临床实践中发现,不同仪器之间检测结果差异较大。这对在同一医院用同一台仪器检测结果的意义影响不大,但在不同医院用不同仪器检测的结果如果存在差异,则会使医师难以判断患者检测指标的准确意义,从而使患者不得不接受重复检查。
总体而言,影响荧光定量PCR检测准确性的关键问题是因试剂质量参差不齐和不同仪器生产厂家所用标准不同造成的。笔者曾按不同厂家的试剂说明进行操作,结果同一标本的结果竟相差100倍,不同厂家所产试剂的检测范围差别较大,最高的检测精确度可达109数量级,但有些厂家的试剂仅能使结果达到107数量级。另外,各实验室所用PCR仪的检测灵敏度各不相同,有些实验室片面追求检测的灵敏度,为此不惜在检测时自行超越试剂的理论检测范围,致使实验室间检测值的差异甚大。
PCR扩增后的分析也对检测结果的准确性有重要影响,对去除PCR干扰物质能力较强、扩增效率较高和荧光抑制降噪性较好的荧光PCR试剂而言,检测后的分析十分简单,因为HBV DNA含量不同的标本间,在结果判断Ct值(Cycle threshold)处荧光扩增效率基本一致,阴性标本的荧光基线多沿0荧光值延伸,而无飘升现象。因此,基线在整体荧光值的3%~8%时,反复检测所测得的定量值差别甚小。市场上销售的部分国产试剂无法达到上述标准,这也是引起实验室间PCR检测结果差异的重要因素。因此,中国药品生物制品检定所和国家卫生部临检中心等相关部门应加大质量监控力度,力争提高我国整体实验室检测质量,缩短实验室间检测差异。
从电泳鉴定HBV DNA的扩增,发展到荧光定量PCR检测,最大的进步是实现了检测过程的封闭,从而减少PCR扩增时样本被污染的机会,提高了检测的灵敏度。但污染现象并没有因此消失,这仍值得相关人员认真研究和对待。
