唾液酸测定法原理及操作方法
本法系用酸水解方法将结合状态的唾液酸变成游离状态,游离状态的唾液酸与间苯二酚反应生成有色化合物,再用有机酸萃取后,测定唾液酸含量。
唾液酸对照品溶液(200μg/ml)的制备 精密称取唾液酸对照品10.52mg(1μg唾液酸相当于3.24nmol),置10ml量瓶中,加水溶解并稀释至刻度,混匀,即为唾液酸贮备液(1mg/ml),按一次使用量分装,-70℃贮存,有效期1年。仅可冻融1次。4℃保存,使用期为2周。精密量取唾液酸贮备液1ml,置5ml量瓶中,加水至刻度,即为每1ml含200μg的唾液酸对照品溶液,用前配制。
用于C群脑膜炎球菌多糖疫苗唾液酸含量测定时,同法制备浓度为400μg/ml的唾液酸对照品溶液贮备液(精密称取唾液酸40mg,置100ml量瓶中,用纯化水溶解并定容至刻度,混匀,即得)。精密量取唾液酸贮备液2.0ml,置10ml量瓶中,加水至刻度,即为每1ml含80μg的唾液酸对照品溶液,用前配制。
测定法 取供试品适量,加水稀释至蛋白质浓度为每1ml含0.2～0.4mg,作为供试品溶液。按下表取唾液酸对照品溶液、水及供试品溶液于10ml玻璃试管中,混匀,每管再加入间苯二酚-盐酸溶液(分别量取2%间苯二酚溶液2.5ml、0.1mol/L硫酸铜溶液62.5μl、25%盐酸溶液20ml,加水稀释至25ml,混匀。试验前4小时内配制)1ml,加盖,沸水煮沸30分钟(水浴面高于液面约2cm),取出置冰浴中3分钟(同时振摇)后,每管加乙酸丁酯-丁醇溶液(取4体积乙酸丁酯与1体积丁醇混匀,室温下保存,12小时内使用)2ml,充分混匀,室温放置10分钟,照紫外-可见分光光度法(通则0401),在波长580nm处测定吸光度。
脑膜炎球菌疫苗唾液酸含量测定:取含唾液酸约40μg/ml的供试品溶液和纯水对照各2ml;另分别取唾液酸对照品(80μg/ml)0.1ml、0.2ml、0.4ml、0.8ml、1.6ml于各管中,补水至2.0ml为标准曲线各点。各管加2ml显色剂(0.1mol/L硫酸铜溶液0.5ml、4%间苯二酚溶液5ml、浓盐酸80ml,补水至100ml混匀。临用现配)摇匀,沸水浴15分钟后冰浴5～10分钟,每管加4ml有机相(正丁醇15ml,加乙酸丁酯定容至100ml),充分摇匀后置室温10分钟。以纯水对照为0点,于585nm测定吸光度,并作直线回归。(可按比例缩小供试品及各试剂体积)
以唾液酸对照品溶液的浓度对其相应的吸光度作直线回归(相关系数应不低于0.99),由直线回归方程计算5μg唾液酸的吸光度值,再按下式计算供试品唾液酸含量。
式中 A1为5μg唾液酸的吸光度;
A2为供试品的吸光度;
n为供试品稀释倍数;
P为供试品蛋白质含量,μg/μl;
W为1nmol促红素的量(不包括糖成分量),相当于30.6μg。
脑膜炎球菌多糖疫苗供试品唾液酸含量(μg/ml)=A×n
式中 A为供试品溶液吸光度相对于唾液酸对照品溶液的浓度,μg/ml;
n为供试品的稀释倍数。
